原理
1. 從動(dòng)物或人組織中提取的細(xì)胞，在體外培養(yǎng)中，細(xì)胞會(huì)有不同程度的分裂增殖，稱(chēng)為增殖性衰老 。但是有些細(xì)胞在自發(fā)或其他條件誘導(dǎo)下可突破增殖性衰老，擁有無(wú)限增殖的能力，成為永生化細(xì)胞，骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞屬于多能干細(xì)胞，可作為組織工程種子細(xì)胞的來(lái)源。
2. 端粒酶對(duì)染色體的穩(wěn)定性及決定細(xì)胞生命周期起極其重要的作用。端粒酶或末端轉(zhuǎn)移酶是由兩個(gè)主要的亞單位構(gòu)成：rna成分（htr）和蛋白質(zhì)分解亞單位（htert），rna（htr）亞單位普遍表達(dá)于正常和腫瘤組織中，而蛋白質(zhì)分解亞單位（htert）僅在腫瘤細(xì)胞、生殖譜系細(xì)胞及激活的淋巴細(xì)胞中表達(dá)。
3. 細(xì)胞衰老機(jī)制現(xiàn)在管遍接受的是細(xì)胞衰老兩階段模型-m1/m2模型，細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中，經(jīng)過(guò)多次分裂后，在腫瘤抑制因于p53和prb等作用下，細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子的反應(yīng)消失，出先有絲分裂反應(yīng)的消失，dna合成抑制蛋白的產(chǎn)生。dna合成停止，細(xì)胞不可逆的停滯于g1期，發(fā)生衰老（sesence. m期），細(xì)胞發(fā)生凋亡或死亡，永生化指的是在體外培養(yǎng)的細(xì)胞自發(fā)的或受外界影響從增殖衰老中逃離，從而具有無(wú)限增殖能力的過(guò)程。
材料與儀器
人間充質(zhì)干細(xì)胞
葡萄糖 l-谷酰胺 胎牛血清 青霉素 鏈霉素 聚凝胺
培養(yǎng)瓶 多孔板
步驟
材料
無(wú)菌
生長(zhǎng)培養(yǎng)基：含高濃度葡萄糖（4.5 g/l）的 dulbecco's modifiled eagle's 培養(yǎng)液（dmem），添加 l-谷酰胺 2 mmol/l、10% 胎牛血清、100u/ml 青霉素及 100 ug/ml 鏈霉素
聚凝胺： 8 mg/ml
普通容器 ：培養(yǎng)瓶 25 cm2，75 cm2
反轉(zhuǎn)錄酶病毒載體的產(chǎn)生用材料
細(xì)胞系:
pg13
gp+e-86
反轉(zhuǎn)錄病毒載體 gcsam htert
轉(zhuǎn)染用 htrt dna
tx 緩沖液：總量 20 ml，含有以下物質(zhì)：
hepes 0.5mol/l，ph 7.1 200ul
nacl，5rnol/l 100ul
na2 hpo4/nah2po4，1mol/l 3ul
upw 1.7 ml
緩沖液 a：總量 20.04 ml，含有以下物質(zhì)：
nacl（5mol/l） 600ul
edta（0.5mol/l）40ul
tris-hcl，ph7.5（0.5mol/l）400ul
upw 19 ml
hmsc（人間充質(zhì)干細(xì)胞）細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)用材料
hmsc（人間充質(zhì)干細(xì)胞）細(xì)胞
培養(yǎng)瓶 75 cm2
多孔板 6 孔
轉(zhuǎn)導(dǎo)后用材料
用于冷凍保存的實(shí)驗(yàn)材料（見(jiàn)方案 20.1）
用于 dna 指紋分析 (見(jiàn)方案 16.8) 或 dna 圖譜分析（見(jiàn)方案 16.9）或其他驗(yàn)證分析方法的實(shí)驗(yàn)材料（如方案 16.10）
pcr 試劑
dna 100 ug/ml
10x pcr 緩沖液 l（含 mg2+）
正向引物（2umol/l）
反義引物（2umol/l）
dntp 混合物（10 mmol/l）
dna 聚合酶
upw
操作步驟
反轉(zhuǎn)錄酶病毒載體的產(chǎn)生
具有 htert 基因的反轉(zhuǎn)錄酶病毒載體通過(guò)兩個(gè)步驟包裝進(jìn)入長(zhǎng)臂猿白血病病毒（galv）包裝的細(xì)胞系 pg13。首先，使用 20 ug/ml htrtdna（geron）轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系 gp+e-86，然后用上清液感染 pg13 細(xì)胞。
1. 6.7x105 gp+e-86 細(xì)胞系接種在一個(gè)小培養(yǎng)瓶（25 cm2）中。
2.gp+e-86 細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染
（a）將 280ul tx 緩沖液加人每個(gè)管中（常用容器）。
（b）制備 dna 管：
組成名稱(chēng) dna 濃度 15 ug dna 緩沖液 a cacl2 2.5mol/l 總量
undefinedug/ul undefinedul 280-30-x 30 280
~undefined x x z = 15 ug
（c）將 tx 緩沖液逐滴加人含有 dna 溶液的管內(nèi)，輕輕地混合。
（d）在室溫下孵育 30℃，使其產(chǎn)生沉淀。
（e）在每個(gè)含有 gp-e-86 細(xì)胞的 25 cm2 培養(yǎng)瓶中，加入 5 ml 新鮮培養(yǎng)液。
（f）輕輕加入混合液（tx+dna）至 gp+e-86 細(xì)胞，在 37℃ 孵育 4-6 h。
（g）在 25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，用 d-pbsa 小心地洗三次。
（h）加新鮮培養(yǎng)液至細(xì)胞中，在 37℃ 孵育過(guò)夜。
3. 更換細(xì)胞培養(yǎng)液，加 2 ml 新鮮培養(yǎng)液 (取代以前 5 ml 培養(yǎng)液)，以產(chǎn)生病毒。
4. 在進(jìn)行第三步的同一天，將 1x104個(gè) pg13 細(xì)胞接種于 6 孔板的每個(gè)孔中。
5. 次日，從感染的 gp-e-86 細(xì)胞收獲其上清液，加入最終濃度為 8 ug/ml 的多聚胺 (如 1 ug/ml 上清液)。
6. 用孔徑 0.45 um 濾膜過(guò)濾上清液，將 2 ml 過(guò)濾液加至含 gp-e-86 細(xì)胞的每個(gè)孔中。
7. 在 32℃ 1000 g 離心培養(yǎng)板。
8. 在 37℃ 孵育過(guò)夜。
9. 次日，更換細(xì)胞的培養(yǎng)液。
hmsc 細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)
1. 將 2x106 pg13 細(xì)胞種人 75 cm2 培養(yǎng)瓶中。
2. 次日，將 6 ml 新鮮培養(yǎng)液加至 pg13 細(xì)胞中。
3. 第三日，將 hmsc 細(xì)胞（約 2.5x104~7.5x104 個(gè)）加至 6 孔板中，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)。
4. 從包裝的細(xì)胞收獲上清液，加入最終濃度為 8 ug/ml 的多聚胺，用孔徑 0.45 um 的濾膜過(guò)濾上清液。
5. 將 2 ml 過(guò)濾后的反轉(zhuǎn)錄病毒上清液加入 6 孔板的每個(gè)孔中。
6. 在 32℃ 1000 g 離心培養(yǎng)板，37℃ 孵育過(guò)夜。
7. 吸去逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，加入新鮮培養(yǎng)基。
轉(zhuǎn)導(dǎo)后培養(yǎng)物的處理
1. 經(jīng)過(guò) 10~12 次傳代接種，未接受 htert 基因的細(xì)胞將死亡，剩余的細(xì)胞 則肯定已插入 htert 基因，具有 htert 基因的細(xì)胞將在傳代過(guò)程中被選擇出來(lái)。
2. 建議將細(xì)胞分裝在安瓿中冷凍保存，建立一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的貯備庫(kù)，這些轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞處于不同的群體倍增（pi）水平（可與 pd 生長(zhǎng)曲線相匹配）。這樣做也可節(jié)省時(shí)間，因?yàn)槿绻l(fā)生污染就要丟棄培養(yǎng)的細(xì)胞，重新開(kāi)始。
3. 在梅次傳代培養(yǎng)時(shí)，用下列公式獲得 pd，以建立 pd 生長(zhǎng)曲線。
3. 更換細(xì)胞培養(yǎng)液，加 2 ml 新鮮培養(yǎng)液 (取代以前 5 ml 培養(yǎng)液)，以產(chǎn)生病毒。
4. 在進(jìn)行第三步的同一天，將 1x104個(gè) pg13 細(xì)胞接種于 6 孔板的每個(gè)孔中。
5. 次日，從感染的 gp-e-86 細(xì)胞收獲其上清液，加入最終濃度為 8 ug/ml 的多聚胺 (如 1 ug/ml 上清液)。
6. 用孔徑 0.45 um 濾膜過(guò)濾上清液，將 2 ml 過(guò)濾液加至含 gp-e-86 細(xì)胞的每個(gè)孔中。
7. 在 32℃ 1000 g 離心培養(yǎng)板。
8. 在 37℃ 孵育過(guò)夜。
9. 次日，更換細(xì)胞的培養(yǎng)液。
hmsc 細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)
1. 將 2x106 pg13 細(xì)胞種人 75 cm2 培養(yǎng)瓶中。
2. 次日，將 6 ml 新鮮培養(yǎng)液加至 pg13 細(xì)胞中。
3. 第三日，將 hmsc 細(xì)胞（約 2.5x104~7.5x104 個(gè)）加至 6 孔板中，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)。
4. 從包裝的細(xì)胞收獲上清液，加入最終濃度為 8 ug/ml 的多聚胺，用孔徑 0.45 um 的濾膜過(guò)濾上清液。
5. 將 2 ml 過(guò)濾后的反轉(zhuǎn)錄病毒上清液加入 6 孔板的每個(gè)孔中。
6. 在 32℃ 1000 g 離心培養(yǎng)板，37℃ 孵育過(guò)夜。
7. 吸去逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，加入新鮮培養(yǎng)基。
轉(zhuǎn)導(dǎo)后培養(yǎng)物的處理
1. 經(jīng)過(guò) 10~12 次傳代接種，未接受 htert 基因的細(xì)胞將死亡，剩余的細(xì)胞 則肯定已插入 htert 基因，具有 htert 基因的細(xì)胞將在傳代過(guò)程中被選擇出來(lái)。
2. 建議將細(xì)胞分裝在安瓿中冷凍保存，建立一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的貯備庫(kù)，這些轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞處于不同的群體倍增（pi）水平（可與 pd 生長(zhǎng)曲線相匹配）。這樣做也可節(jié)省時(shí)間，因?yàn)槿绻l(fā)生污染就要丟棄培養(yǎng)的細(xì)胞，重新開(kāi)始。
3. 在梅次傳代培養(yǎng)時(shí)，用下列公式獲得 pd，以建立 pd 生長(zhǎng)曲線。
公式中的 pd 代表種群倍增的次數(shù)，in 是自然對(duì)數(shù) nstart 是細(xì)胞初始接種量，nfinish 是細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過(guò)程中所獲得的全部細(xì)胞數(shù)。
例 1，如果最初種入 2x105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)后增加至 3.2x106個(gè)細(xì)胞，則：
如果按 1:4 的細(xì)胞量進(jìn)行傳代培養(yǎng)，則每次傳代培養(yǎng)后的 nfinish 將乘以 4。所以在上述例子中，假設(shè)有 10 次傳代培養(yǎng)，nfinish 就是（3.2x106）x4 的 10 倍，也就是 3.4x1012。
例 2，如果最初種入 2x105 個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)后可增加至 3.2x106個(gè)細(xì)胞。以 1:4 的細(xì)胞址傳代培養(yǎng) 10 次，則：
4. 在建立永生細(xì)胞系之后，必須檢查其真實(shí)性，以確保其來(lái)源于最初的材料， 而不是由于交叉污染從實(shí)驗(yàn)室其他永生細(xì)胞系衍生而來(lái)。這是能做到的，例如針對(duì)轉(zhuǎn)移基因的 pcr 檢測(cè)、dna 指紋檢測(cè)或 dna 圖譜檢測(cè)。
htert 的 pcr
1. 溶解 pcr 試劑并保存在冰塊中
2. 對(duì)下列試劑進(jìn)行仔細(xì)的混合，記住，一定要包括陽(yáng)性對(duì)照（其他 htert 陽(yáng) 性標(biāo)本）和陰性對(duì)照（無(wú) dna 模板）
dna1ul（100ng） 100 ug/ml
10xpcr 緩沖液（含mg2+） 2ul
正義引物 2ul
反義引物 2ul
dntp 混合物（10 mmol/l） 0.4ul
dna 多聚酶 0.1ul
upw 12.5ul
最終體積為 20 ml（包括 dna）
3. 將管子置于 pcr 儀器中，按以下步驟進(jìn)行操作：90℃，3 min，首*行變性作用；94℃，30s，再次進(jìn)行變性作用；59℃，39s，進(jìn)行復(fù)性；74 ℃，1 min，進(jìn)行延伸；如此循環(huán) 30 個(gè)周期，然后是 74℃，1 min。
4. 將 pcr 產(chǎn)物在 1.5%~2% 瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。
注意事項(xiàng)
1、將細(xì)胞分裝在安瓿中冷凍保存，建立一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的貯備庫(kù)，這些轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞處于不同的群體倍增（pi）水平（可與 pd 生長(zhǎng)曲線相匹配）。這樣做也可節(jié)省時(shí)間，因?yàn)槿绻l(fā)生污染就要丟棄培養(yǎng)的細(xì)胞，重新開(kāi)始。
2、在建立永生細(xì)胞系之后，必須檢查其真實(shí)性，以確保其來(lái)源于最初的材料， 而不是由于交叉污染從實(shí)驗(yàn)室其他永生細(xì)胞系衍生而來(lái)。