張藝萍，屈云慧，熊麗，王祥寧，吳學(xué)尉
摘要：百合病毒病是為害百合生產(chǎn)的一類重要病害，防止百合感染病毒病最好的方法是采用脫毒培養(yǎng)技術(shù)獲得脫毒苗，并跟蹤檢測，以保證種球的無毒。本文系統(tǒng)論述了百合脫毒技術(shù)的研究進(jìn)展，重點(diǎn)對常用的脫毒技術(shù)進(jìn)行了綜述。
關(guān)鍵詞：百合；脫毒；研究進(jìn)展
百合學(xué)名lilium，為百合科百合屬多年生球根類草本植物。全世界約有100多種，我國栽培約有60多種川。著名的有蘭州百合、卷丹百合、江蘇宜興百合、麝香百合等。百合花大，花姿優(yōu)美，特別是東方百合(l oriental hybrids)還具有濃郁的芳香，深受人們的喜愛。百合切花是目前世界上發(fā)展最快的花卉之一，市場前景廣闊。百合以有性方式（種子繁殖）和無性方式進(jìn)行繁殖，商業(yè)上主要以扦插繁殖和分球繁殖等無性繁殖為主。但長期的無性繁殖會(huì)使病毒在體內(nèi)積累，引發(fā)病毒病，嚴(yán)重影響果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)以及花和葉等的觀賞價(jià)值。如何減少和消除病毒病，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)無毒種苗，是百合種球商品化生產(chǎn)面臨的一個(gè)重要問題。
本文就百合的病毒病、脫毒方法和檢測技術(shù)做一系統(tǒng)的綜述。
1 百合的病毒病
植物病毒主要是通過植物營養(yǎng)體無性繁殖傳播的。無性繁殖方式的優(yōu)點(diǎn)在于能保持其后代遺傳基礎(chǔ)的一致，較少發(fā)生變異。然而長期的無性繁殖將會(huì)使體內(nèi)逐漸積累大量病毒致使植物發(fā)生病毒病，并導(dǎo)致種性退化。百合也不例外，病毒病經(jīng)常對百合生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。自stewart (1896)描述百合的壞死條紋以來，相繼報(bào)道了百合的病毒病原14種。其中發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重的病毒有5種，即百合潛隱病毒(lily symptomless vims，lsv)；黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus，cmv)；郁金香碎錦病毒(tulip breaking virus，tbv)；異名百合斑駁病毒(lilymottle virus，lmov)和百合叢簇病毒(lily rosette virus，lrv)。其余9種病毒在栽培地區(qū)少量發(fā)生，對百合構(gòu)不成普遍危害，如百合x病毒(lily virus x，lvx);百合環(huán)斑病毒(lily ring spot virus，lrsv);水仙花病毒(narcissus virus，nmv)和煙草環(huán)斑病毒(tobacco ringspot virus，trsv)等。
2百合的脫毒技術(shù)
對百合脫毒研究最早的是phillips（1962年），他利用百合莖尖培養(yǎng)脫毒成功以后，又有許多外國學(xué)者利用莖尖脫毒成功，1966年mori和hamaya通過莖尖培養(yǎng)獲得了百合無病毒植株。目前國際上有幾個(gè)國家利用這種方法獲得百合無病毒苗，并在生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用。除
此之外還有一些新的途徑，據(jù)淺野等人（1978年）利用麝香百合的花絲進(jìn)行組培，也得到了無病毒的小鱗莖。通過離體培養(yǎng)技術(shù)，以色列也成功建立了百合的脫毒程序。
阻斷病毒傳播獲得脫毒苗的基本方法有：莖尖培養(yǎng)、珠芽培養(yǎng)、化學(xué)處理、熱處理。
2.1莖尖培養(yǎng)
莖尖培養(yǎng)脫毒的依據(jù)是：病毒在患病的植株上分布不均勻，在較老的器官和組織內(nèi)病毒含量較高，在幼嫩的或未成熟的組織和器官中病毒含量較低，而莖尖是植株中最年輕，細(xì)胞分裂最活躍的部位；病毒一般通過維管束轉(zhuǎn)移，莖尖分生組織沒有維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞，趕不卜細(xì)胞分裂和生長的速度，所以它幾乎不含或很少含病毒。植物莖尖中無毒生長點(diǎn)培養(yǎng)，成了去除植物中病毒使植物復(fù)壯的重要方法。
莖尖脫毒培養(yǎng)的2個(gè)關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)足莖尖的成活率和脫毒率。莖尖培養(yǎng)成活率低，褐化足降低莖尖培養(yǎng)成活率的首要因素。褐化的發(fā)生與許多因素有關(guān)，莖尖大小、取材季節(jié)、培養(yǎng)方式、激素濃度、基本培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加物都對莖尖褐化有影響，例如莖尖越小，褐化越嚴(yán)重、成活率越低。在莖尖培養(yǎng)時(shí)為抑制褐化的發(fā)生，需要優(yōu)化上述各因了。應(yīng)用抗氧化劑ac和vc也可有效抑制莖尖培養(yǎng)的褐化現(xiàn)象。
百合通過莖尖培養(yǎng)，tbv、cmv、lsv等病毒的檢出率可降至7%以下，可有效地脫除病毒。云南省農(nóng)科院花卉所的研究表明，剝?nèi)?.2 - 0.3 mm的莖尖成苗率可達(dá)到78%，但脫毒率僅為43%。
2.2珠芽培養(yǎng)
珠芽培養(yǎng)時(shí)先剝掉外部鱗片，把帶有葉原基的珠芽生長點(diǎn)經(jīng)消毒，無菌水沖洗數(shù)次后，剝掉部分葉原基，最后將帶有1-2個(gè)葉原基的生長點(diǎn)在解剖鏡下切成0.3 - 1.2 mm不同長庋小段進(jìn)行培養(yǎng)。趙樣云等實(shí)驗(yàn)表明，利用0.3 - 0.8 mm珠芽生長點(diǎn)對淡黃花百合進(jìn)行離體培養(yǎng)，通過脫分化產(chǎn)生愈傷組織，然后將愈傷組織冉分化成芽，最后培育出的幼苗可成功地脫去煙草環(huán)斑病毒。
2.3化學(xué)處理
抑制植物病毒的活性化學(xué)物質(zhì)包括代謝拮抗物質(zhì)、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等，其中·些巳用于植物脫毒研究。病毒唑是廣譜性抗病毒藥物，國外在20世紀(jì)70年代末和80年代初，一些科學(xué)家將這種抗動(dòng)物病毒的藥物應(yīng)用于植物，成功地脫去了馬鈴薯x病毒、黃瓜花葉病毒和苜?；ㄈ~病毒等。xu等將感染r cmv、lsv、tbv的百合鱗片接種于含病毒唑或二硫脲嘧啶的培養(yǎng)基上，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，病毒濃度降低，約400/"再生的小鱗莖可脫除病毒。百合離體培養(yǎng)過程中加入抗病毒抑制劑dht，可有效地去除cmv和lsv，并且對芽的分化影響很小。在百合生產(chǎn)上，采用礦物油、植物油、殺蟲劑和外激素噴灑，可控制百合病毒病蔓延。也可采用礦物油和擬除蟲菊酯殺蟲劑混合物進(jìn)行噴灑，控制百合蚜蟲傳播的百合潛隱病毒和百合斑駁病毒。
2.4熱處理
熱處理依據(jù)是在高溫下病毒出現(xiàn)鈍化，其復(fù)制明顯減弱或不再繁殖。將植物在高溫下培養(yǎng)數(shù)周至數(shù)月，這個(gè)期間生長的嫩梢不帶病毒。植株的存活率和脫毒率受溫度的高低和持續(xù)時(shí)間長短的影響。大部分百合病毒在50-65℃活性穩(wěn)定，所以處理溫度在65 -75℃，才能鈍化病毒。但溫度過高，會(huì)降低植株的成活率。在實(shí)踐中，利用較高溫度處理時(shí)，縮短處理時(shí)間，溫度較低時(shí)適當(dāng)延長處理時(shí)問。
上述4種方法是脫毒常用的方法，也有將2個(gè)方法結(jié)合起來做的，比如莖尖培養(yǎng)和熱處理相結(jié)合來做，珠芽培養(yǎng)和熱處理結(jié)合來做，xu等就比較了化學(xué)療法和熱處理配合脫除病毒的效果。將鱗片培養(yǎng)在含病毒唑的培養(yǎng)基上，保持35℃高溫4周，脫毒效果比單獨(dú)使用化學(xué)療法或熱處理的效果好[7]。云南省農(nóng)科院花卉所的研究表明，脫毒率最好的為熱處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合方法，大小為0.2 - 0.3 mm的莖尖脫毒率為67%，大小為1mm的莖尖脫毒率可達(dá)21%。
3 百合的病毒檢測
脫毒之后的組培材料需進(jìn)行病毒檢測，方能確定脫毒率及所用脫毒方法的可行性。目前，主要的檢測方法有：酶聯(lián)免疫吸附測定法、點(diǎn)免疫結(jié)合實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)技術(shù)檢測。
3.1酶聯(lián)免疫吸附測定法
現(xiàn)在應(yīng)用最廣泛的植物病毒檢測方法就是酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)。植物病毒是由蛋白質(zhì)和核酸組成的核蛋白，是一種很好的抗原，注射到動(dòng)物后會(huì)產(chǎn)生抗體。由于不同病毒產(chǎn)生的抗血清具有特異的識(shí)別特性，因此可以用已知病毒的抗血清鑒定病毒種類。elisa的靈敏度較高，可檢測到納克(ng，10g)水平的病毒。然而，elisa難于檢測更低濃度的病毒。
32點(diǎn)免疫結(jié)合實(shí)驗(yàn)
點(diǎn)免疫結(jié)合實(shí)驗(yàn)(diba)是檢測百合上病毒cmv、lsv和lmov的常規(guī)方法。jkim等通過病毒侵染后產(chǎn)生的癥狀，采用組織印跡和diba方法對百合栽培品種喬治、凝星等進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，上述百合品種主要感染的病毒有百合潛隱病毒、黃瓜花葉病毒和郁金香碎錦病毒。
3.3分子生物學(xué)檢測
分子生物學(xué)技術(shù)通過檢測病毒核酸來證實(shí)病毒的存在，其特點(diǎn)是靈敏度比elisa還高，特異性強(qiáng)、檢測快速，可用于大量樣品的檢測，并且適應(yīng)范圍廣，應(yīng)用對象可以是rna病毒、dna病毒和類病毒。目前常用的分子生物學(xué)技術(shù)包括核酸分子雜交技術(shù)、雙鏈rna電泳技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄pcr (rt-pcr)技術(shù)。
rt-pcr技術(shù)已用于檢測許多植物病毒，在百合上rt-pcr用于克隆cmv、lsv和lmov外殼蛋白基因，但用于檢測百合病毒的報(bào)道很少。kim等采用一步rt-pcr的方法可快速準(zhǔn)確地檢測出百合無癥病毒、黃瓜花葉病毒，百合斑駁病毒等。yoshijiniimi等(2003)設(shè)計(jì)簡并引物，采用rt- pcr方法成功地檢測了百合品種casa blanca、avignon和white aga的病毒cmv、lsv和lmov。洪健等采用雙鏈rna電泳技術(shù)、核酸分子雜交技術(shù)和rt-pcr等方法鑒定和檢測東方百合上的病毒。用rt-pcr技術(shù)檢測百合病毒無放射性危險(xiǎn)，可以檢測到飛克
（fg，l0-15 9）數(shù)量級(jí)的植物病毒及大規(guī)模的樣品。
通過脫毒培養(yǎng)獲得的組培苗，經(jīng)病毒檢測證實(shí)健康優(yōu)質(zhì)，即可進(jìn)行增殖培養(yǎng)，從而獲得大量優(yōu)質(zhì)種苗。而無毒系的保持，就需要在每個(gè)生產(chǎn)階段跟蹤檢測，以避免再次感染病毒。云南省農(nóng)科院花卉所已建立了一套完整的生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程。