2023年2月8日，俄亥俄州立大學(xué)董一州團(tuán)隊(duì)在advanced science發(fā)表了一篇lnp成功遞送sarna至精母細(xì)胞治療小鼠不育的文章——cholesterol-amino-phosphate (cap) derived lipid nanoparticles for delivery of self-amplifying rna and restoration of spermatogenesis in infertile mice?；蛲蛔円鸬哪行圆挥Y是不育癥的重要類型。目前，臨床上還沒有可靠的方法來解決這種醫(yī)療需求。mrna療法的出現(xiàn)為修復(fù)生殖系統(tǒng)中的突變基因提供了一種可能的策略。然而，將mrna有效遞送至精母細(xì)胞仍然是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)。因此，研究團(tuán)隊(duì)希望開發(fā)一種新的lnp可以將sarna有效遞送至精母細(xì)胞，用于治療男性不育癥。
一、cap lnp的合成、配方和表征為了增強(qiáng)mrna遞送進(jìn)入精子細(xì)胞，在生物膜和男性生殖系統(tǒng)起到關(guān)鍵作用的一些生物活性分子引起研究人員的關(guān)注。例如，膽固醇是哺乳動物細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)成分，維持細(xì)胞膜的完整性和通透性。先前有研究報道在精子生成過程中膽固醇水平會升高，這表明膽固醇代謝與生育能力之間存在密切關(guān)系。此外，磷酸基團(tuán)是磷脂的極性部分，同時也是是生物膜的關(guān)鍵組成部分，參與細(xì)胞運(yùn)輸途徑。最后，氨基可以電離變?yōu)檎娦缘?，與帶負(fù)電的mrna相互作用。除了生物活性之外，可電離的脂質(zhì)的幾何結(jié)構(gòu)，可以用包封參數(shù)（p值）來描述，會極大地影響 lnps的傳遞效率。通常，p 值大的脂質(zhì)有利于形成倒錐形，有利于內(nèi)體膜的倒六邊形（hii 相）轉(zhuǎn)變和遞送貨物的內(nèi)體逃逸。為了實(shí)現(xiàn) lnps 將編碼功能蛋白的 mrna 遞送進(jìn)精母細(xì)胞中，恢復(fù)精子生成的目標(biāo)，他們整合了3個生物活性分子單元，設(shè)計(jì)一系列膽固醇-氨基-磷酸酯（cap）脂質(zhì)，配制成cap lnps。cap lnp 由cap、dope、dmg-peg和編碼dmc1的mrna配制而成。在顯微注射到曲細(xì)精管后，cap lnp將dmc1 mrna遞送到精母細(xì)胞，從而恢復(fù)染色體重組和精子發(fā)生。
圖1 使用cap lnp遞送編碼dmc1的 mrna 的示意圖
首先，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一條 cap 衍生物的合成路線（圖 2a），并進(jìn)一步表征了它們的理化性質(zhì)，最終選擇了cap2-4 lnps進(jìn)行后續(xù)研究。研究者應(yīng)用 cap2-4 lnp 在dmc1 -/-小鼠模型中遞送綠色熒光蛋白(gfp) mrna，24小時后分析 gfp 的表達(dá)。如圖 2e所示，cap2-4 lnps 在曲細(xì)精管周圍誘導(dǎo)出明顯的綠色熒光，而 mc3 lnps 和 alc-0315 lnps 組中幾乎檢測不到 gfp 信號。這些結(jié)果證明 cap2-4 lnps 是精母細(xì)胞中 mrna 遞送的優(yōu)良載體，遞送效率明顯高于 mc3 和 alc-0315 lnps。
圖2 cap 脂質(zhì)的合成方法、3d結(jié)構(gòu)以及在生精小管中的遞送效率比較
二、cap lnp可將sarna遞送至dmc1-/-小鼠模型中的精母細(xì)胞接下來，作者比較了傳統(tǒng) mrna和sarna 之間 dmc1 蛋白的表達(dá)時程。他們將帶有 flag 標(biāo)簽的 dmc1 mrna 或 sarna 封裝到cap2-4 lnp 中，并將兩種制劑注射到 dmc1-/-小鼠的曲細(xì)精管中。給藥后24和72小時，通過免疫熒光染色評估曲細(xì)精管中 dmc1 的表達(dá)。如圖3a所示，在cap2-4 lnp-mrna和cap2-4 lnp-sarna 處理的小鼠中24小時均觀察到明顯的 dmc1 表達(dá)，但在未處理的小鼠中則沒有。cap2-4 lnp-mrna給藥72小時后，曲細(xì)精管中幾乎沒有熒光信號（圖3b）。相反，cap2-4 lnp-sarna處理組仍然顯示出強(qiáng)烈的熒光信號（圖3b）。這些結(jié)果表明，通過 cap2-4 lnp 遞送 sarna 可以維持 dmc1 蛋白表達(dá)至少三天。
圖3 在 dmc1-/-小鼠中遞送編碼 dmc1蛋白的傳統(tǒng)mrna或sarna
三、使用cap lnp遞送sarna恢復(fù)dmc1蛋白功能隨后，作者通過分析聯(lián)會復(fù)合體 (sc)來檢查 dmc1 蛋白的功能。sc 是在減數(shù)分裂 i 期間形成的特定結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)同源染色體的聯(lián)會。由于 dmc1 缺陷可破壞 sc 形成并阻止減數(shù)分裂 i 后期的精子發(fā)生，因此 sc 被認(rèn)為是 dmc1 蛋白功能恢復(fù)的關(guān)鍵指標(biāo)。dmc1-/-小鼠用 cap2-4 lnp-sarna 處理，處理后第 4天，收集睪丸。通過 sycp1 和 sycp3（參與 sc 形成的兩個主要成分）的免疫熒光染色檢查精母細(xì)胞中的 sc。如圖4a所示, sycp3和sycp1染色清楚地顯示了 wt 小鼠的五個亞階段的特征模式，包括細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期、終變期。在cap2-4 lnp-sarna 處理組中，我們觀察到處于粗線期的sc，這表明同源染色體聯(lián)會的恢復(fù)。此外，對sc在雙線期和終變期的觀察進(jìn)一步證實(shí)了sc可以解體并轉(zhuǎn)運(yùn)到中期（圖4b）。相反，來自 dmc1-/-小鼠的 sc 在前期的早期階段被阻滯，并且未觀察到粗線期、雙線期和終變期的 sc（圖4c）。如圖4d所示，在 cap2-4 lnp-sarna 處理后，粗線期、雙線期和終變期精母細(xì)胞的百分比分別增加到 11%、6% 和 2%。總的來說，這些結(jié)果表明使用 cap lnp 遞送 sarna 可恢復(fù)精母細(xì)胞中 dmc1 蛋白的功能。
圖4 使用cap lnp遞送sarna可恢復(fù)dmc1-/-小鼠中的dmc1功能
四、cap lnp-sarna 挽救 dmc1-/-小鼠的精子發(fā)生最后，作者研究了通過 cap2-4 lnp-sarna 恢復(fù) dmc1 蛋白是否可以挽救 dmc1-/-小鼠的不育癥。dmc1-/-小鼠用 cap2-4 lnp-sarna 處理。處理后第10天，收集睪丸和附睪。睪丸和附睪切片用花生凝集素 (pna)染色，它可以特異性結(jié)合精子細(xì)胞頂體（圖5a）。pna 染色的精子細(xì)胞位于 wt 小鼠的曲細(xì)精管和附睪管中。然而，dmc1-/-小鼠的睪丸和附睪中沒有細(xì)胞被 pna-凝集素染色，表明精子細(xì)胞生產(chǎn)全喪失。相比之下，我們在 cap2-4 lnp-sarna 治療組的曲細(xì)精管和附睪管中觀察到了 pna染色的細(xì)胞，這是挽救 dmc1-/- 小鼠不育表型的直接證據(jù)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，治療組每根小管的pna陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于未治療組，達(dá)到wt組的二分之一左右（圖5b）。因此，這些結(jié)果證明，使用 cap lnp 遞送 sarna可以有效挽救 dmc1-/-小鼠中的精子細(xì)胞產(chǎn)生。此外，對睪丸樣本進(jìn)行組織學(xué)分析以評估生精發(fā)育。如圖5c所示，wt 小鼠表現(xiàn)出正常的睪丸形態(tài)，而 dmc1-/-小鼠在精母細(xì)胞階段表現(xiàn)出精子發(fā)生停滯并且缺乏減數(shù)分裂后細(xì)胞。與 wt 小鼠相比，dmc1-/-小鼠的生發(fā)層厚度和生精管直徑顯著降低（圖5d，e）。相比之下，cap2-4 lnp-sarna 重建了 dmc1-/-小鼠的睪丸形態(tài)，增加了生發(fā)層厚度和生精管直徑（圖5d，e)。精子懸液細(xì)胞學(xué)涂片顯示，cap2-4 lnp-sarna處理組的附睪產(chǎn)生橢圓頭單尾不卷曲的精子，而未處理組未觀察到精子樣細(xì)胞（圖 5f）。
圖5 使用 cap lnp 遞送sarna可挽救 dmc1 -/-小鼠的不育表型
總的來說，這項(xiàng)研究利用 cap lnps 可以向精母細(xì)胞傳遞 mrna，證明基于mrna療法在治療由基因突變引起的男性生殖疾病方面的可行性。
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參考文獻(xiàn)：【1】 du s, li w, zhang y, et al. cholesterol-amino-phosphate (cap) derived lipid nanoparticles for delivery of self-amplifying rna and restoration of spermatogenesis in infertile mice. adv sci (weinh). 2023 feb 7:e2300188.
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