早產(chǎn)現(xiàn)象是造成新生兒發(fā)病與死亡的主要原因，早產(chǎn)占所有分娩數(shù)的5%-15%。在正常妊娠期間，胎膜（由外層的平滑絨毛膜和內(nèi)層的羊膜組成）必須保持完整性，直至分娩。雖然胎膜常在分娩時(shí)破裂，但在此之前，生物化學(xué)和生物物理變化被認(rèn)為會(huì)減弱胎膜。膜破裂前可見(jiàn)的生化變化包括炎癥和氧化應(yīng)激，它們?cè)谀と趸衅鸬胶艽蟮淖饔?。子宮內(nèi)氧化應(yīng)激累積會(huì)加速炎癥的積累，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)成分降解，從而導(dǎo)致胎膜變?nèi)?。作為氧化?yīng)激和炎癥的誘導(dǎo)劑，拉伸力在胎膜弱化過(guò)程中也很重要。
盡管與分娩相關(guān)的研究較少，但轉(zhuǎn)錄因子nfe2相關(guān)因子2（nrf2）是一種參與調(diào)節(jié)dna轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞存活和炎癥調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)復(fù)合物。nrf2已成為抗氧化反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，并與氧化應(yīng)激相關(guān)的毒性和慢性疾病有關(guān)。雖然已知nrf2可由ros和細(xì)胞應(yīng)激激活，但過(guò)度的應(yīng)激條件（如膿毒性休克和高水平的氧化應(yīng)激）會(huì)矛盾地?fù)p害nrf2的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥和組織損傷增加。已證明nrf2缺乏與核因子-kb（nf-kb）介導(dǎo)的炎癥有關(guān)。然而，nrf2也隨分娩而降低，其活化會(huì)降低細(xì)胞因子il-6的表達(dá)。但是目前，拉伸對(duì)nrf2活性的影響尚未在胎膜的羊膜細(xì)胞中專(zhuān)門(mén)探索。由于高水平的氧化應(yīng)激和增加的炎癥與胎膜的減弱有關(guān)，因此nrf2的作用，特別是其下調(diào)，與此有關(guān)。
基于此，在美國(guó)夏威夷大學(xué)馬諾阿分校醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)、生物化學(xué)與生理學(xué)系，韋恩州立大學(xué)醫(yī)學(xué)院等團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究中，旨在確定體外拉伸對(duì)羊膜上皮細(xì)胞應(yīng)激和nrf2的影響。實(shí)驗(yàn)假設(shè)體外拉伸會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，激活促炎介質(zhì)；ros，hmgb1和nf-kb，同時(shí)下調(diào)nrf2。 由于其在細(xì)胞保護(hù)中的作用，闡明體外拉伸對(duì)nrf2的影響可以深入了解其在胎膜中的作用。
拉伸誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)
前期已經(jīng)證明對(duì)人羊膜上皮細(xì)胞（haecs）的拉伸可以增加促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，因此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表征了由這種刺激誘導(dǎo)的haecs的細(xì)胞反應(yīng)。體外拉伸裝置設(shè)置為20% 的循環(huán)拉伸和釋放實(shí)驗(yàn)持續(xù)4、8和16小時(shí)，間隔27秒拉伸幅度為20%，然后將拉伸釋放7秒至0%。乳酸脫氫酶（ldh）活性的速率是細(xì)胞應(yīng)激的非特異性標(biāo)志物。結(jié)果表明，拉伸4 h顯著提高了ldh活性（圖1 a）。由于ldh數(shù)據(jù)提供了拉伸引起細(xì)胞應(yīng)激的證據(jù)，因此研究了拉伸對(duì)危險(xiǎn)相關(guān)分子模式分子hmgb1的直接影響。在haec拉伸4 h 的條件培養(yǎng)基中，hmgb1分泌量顯著增加（圖1 b）。由于haecs顯示細(xì)胞在拉伸后變得應(yīng)激，因此通過(guò)用免疫熒光測(cè)量nf-kb p65亞基易位到細(xì)胞核來(lái)測(cè)量其對(duì)促炎nf-kb級(jí)聯(lián)反應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，haec拉伸4 h 顯著增加了nf-kb p65亞基核易位（圖1 c）。
圖1 機(jī)械拉伸增加了ldh活性，hmgb1分泌和nf-kb的活化。
（a）動(dòng)力學(xué)測(cè)量的ldh活性（mu/μl）隨著拉伸而增加。（b）elisa定量拉伸4小時(shí)和未拉伸haecs的細(xì)胞培養(yǎng)上清液hmgb1（ng/μl）的含量。（c）haecs中p65蛋白核定位的免疫熒光分析。（i,ii）對(duì)照原代羊膜上皮細(xì)胞的dapi-藍(lán)（1μg/ ml）和p65（1/500）染色。（iv,v）分別對(duì)拉伸的原代羊膜上皮細(xì)胞進(jìn)行dapi和p65染色。（iii,vi）分別合并了對(duì)照細(xì)胞和拉伸細(xì)胞的 dapi 和 p65 信號(hào)。
nrf2在人胎膜細(xì)胞中表達(dá)，并在haec分離和細(xì)胞培養(yǎng)后保持表達(dá)
nrf2水平已被證明隨著分娩在胎膜中降低。因此，實(shí)驗(yàn)使用模型系統(tǒng)研究拉伸對(duì)nrf2表達(dá)的影響，試圖確定在人類(lèi)胎膜收集期的基礎(chǔ)表達(dá)水平是否足夠高，以便研究其調(diào)節(jié)機(jī)制。對(duì)收集的胎膜組織的定性免疫組織化學(xué)分析顯示， 與 igg（對(duì)照）染色相比，nrf2在羊膜、絨毛膜和蛻膜細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)烈（圖2 a）。在羊膜中，羊膜間充質(zhì)細(xì)胞（haecs）的nrf2表達(dá)信號(hào)相對(duì)強(qiáng)于對(duì)照組（圖2 c、d）。然而，haec和hamc nrf2信號(hào)都具有強(qiáng)大的核表達(dá)。然后，在收集的羊膜細(xì)胞中確認(rèn)了nrf2在基因水平上的表達(dá)，并將其與hela污染的羊膜上皮樣細(xì)胞（wish），胎盤(pán)組織和hamcs中的nrf2表達(dá)進(jìn)行了比較（圖2 e）。此外還測(cè)量了hamcs的表達(dá)，因?yàn)槊庖呓M織化學(xué)發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞具有強(qiáng)表達(dá)（圖2 a）。haecs和hamcs的基因表達(dá)水平均低于wish細(xì)胞系，但高于分離的胎盤(pán)組織。haecs的nrf2表達(dá)高于hamcs。異硫氰酸熒光素（fitc）標(biāo)記的nrf2的免疫細(xì)胞化學(xué)分析進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞分離后 nrf2 在 haecs 中的表達(dá)（圖2 f-h）。
圖2 haecs在人胎膜組織采集和隨后的細(xì)胞分離和培養(yǎng)后強(qiáng)烈表達(dá)nrf2。
（a）nrf2在胎膜中的代表性免疫組織化學(xué)圖像，放大倍數(shù)20×nrf2（b）igg對(duì)照。（c）羊膜層nrf2和（d）igg染色組織羊膜層igg染色組織。（e）歸一化為gapdh的nrf3表達(dá)的qpcr分析。（f-h）haecs中 nrf2 表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)，分別放大 60x fitc標(biāo)記的 nrf2、dapi 染色和合并圖像。
體外拉伸下調(diào)人羊膜上皮細(xì)胞nrf2的表達(dá)
已經(jīng)確認(rèn)nrf2在haecs 組織和細(xì)胞水平上的穩(wěn)健基線表達(dá)（圖2 d），因此實(shí)驗(yàn)使用這種羊膜細(xì)胞類(lèi)型來(lái)確定機(jī)械拉伸對(duì)該轉(zhuǎn)錄因子的影響。haec最初進(jìn)行 20% 的循環(huán)拉伸持續(xù)4、8和16小時(shí)。拉伸4 h后，與未拉伸細(xì)胞的對(duì)照相比，細(xì)胞內(nèi) nrf2的水平顯著降低（圖3 a）。拉伸8和16 h后，nrf2表達(dá)降低，但nrf2蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異，因?yàn)樵谖蠢鞂?duì)照條件下，nrf2表達(dá)也降低。由于20%循環(huán)拉伸持續(xù)4 h導(dǎo)致nrf2表達(dá)與對(duì)照條件相比顯著降低，因此研究了nrf2易位到細(xì)胞核的影響，結(jié)果表明，機(jī)械拉伸使細(xì)胞核nrf2表達(dá)顯著降低（圖3 b）。這些結(jié)果證實(shí)了機(jī)械拉伸導(dǎo)致nrf2水平的降低。由于nrf2在拉伸后被下調(diào)，而ros的產(chǎn)生可以下調(diào)nrf2活性，因此在拉伸后測(cè)量了ros的產(chǎn)生，結(jié)果表明，拉伸后nrf2表達(dá)的降低伴隨著ros產(chǎn)生的增加（圖3 c）。
圖3 拉伸顯著降低nrf2表達(dá)。
（a）nrf2（100 kda）和β-肌動(dòng)蛋白（42 kda）的全細(xì)胞裂解物。（b）20% 循環(huán)拉伸4小時(shí)后nrf2（100 kda）和層粘連蛋白b1（70 kda）表達(dá)的核裂解物蛋白質(zhì)印跡。（c）通過(guò)dcf（nm）量化ros的生成，其隨拉伸而增加。
蘿卜硫素在拉伸的羊膜細(xì)胞中挽救獨(dú)立于 ros 的 nrf2
蘿卜硫素已被證明在特定的濃度下通過(guò)激活nrf2信號(hào)通路能夠引發(fā)一連串抗氧化酶的產(chǎn)生，可有效減輕氧化應(yīng)激和組織/細(xì)胞損傷。由于nrf2被認(rèn)為在與早產(chǎn)相關(guān)的促炎途徑中發(fā)揮作用，因此對(duì)1、2 μm蘿卜硫素處理的細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械拉伸，以研究其對(duì)nrf2易位和活性的影響。首先，利用ldh活性量化蘿卜硫素處理對(duì)細(xì)胞毒性的影響。在拉伸或?qū)φ諚l件下，0、1或2 μm蘿卜硫素處理后ldh活性沒(méi)有顯著差異（圖4 a）。此外，在haecs拉伸4 h后，1 μm蘿卜硫素處理提高了57.8% 的核nrf2水平，而2 μm蘿卜硫素處理導(dǎo)致核nrf2水平顯著增加122.2%（圖4 b）。由于蘿卜硫素改善拉伸誘導(dǎo)nrf2下調(diào)，因此還研究了其對(duì)ros產(chǎn)生的影響。蘿卜硫素處理對(duì)haecs的ros產(chǎn)生沒(méi)有顯著影響，因?yàn)樵谒刑}卜硫素濃度下，ros隨拉伸而顯著增加（圖4 c）。
圖4 蘿卜硫素拯救了獨(dú)立于拉伸的拉伸介導(dǎo)的nrf2下調(diào)。
（a）動(dòng)力學(xué)測(cè)量用蘿卜硫素處理的ldh活性。（b）蘿卜硫素處理下核nrf2蛋白相對(duì)于層粘連蛋白b1的表達(dá)。（c）用蘿卜硫素處理的dcf生成。
圖5 nrf2和nf-kb活性取決于細(xì)胞應(yīng)激水平的綜述。
（a-c）轉(zhuǎn)錄因子nrf2和nf-kb的激活取決于細(xì)胞應(yīng)激的水平。（a）說(shuō)明沒(méi)有明顯壓力的正常生理狀況。泛素化的nrf2與keap1結(jié)合，nf-kb-p65與ikb結(jié)合，從而抑制它們易位到細(xì)胞核中。（b）中度壓力的影響，例如懷孕的第三個(gè)月。nrf2與keap1分離，這允許核易位并與are基序特異性基因結(jié)合。nf-kb-p65仍然與細(xì)胞質(zhì)中的ikb結(jié)合。（c）嚴(yán)重的壓力導(dǎo)致分娩和細(xì)胞伸伸。升高的應(yīng)激導(dǎo)致keap1-nrf2復(fù)合物的移除和ikkb的激活，從而抑制了ikb的抑制，激活了nf-kb-p65并導(dǎo)致二聚體易位到細(xì)胞核中并與relb基序特異性基因結(jié)合。（d、e）人羊膜上皮細(xì)胞（d）未拉伸，（e）拉伸20%。拉伸的細(xì)胞增加細(xì)胞質(zhì)ros，hmgb1的分泌和ldh活性。還顯示總nrf2和核nrf2減少，核nf-kb-p65增加。
該研究重點(diǎn)是了解了妊娠末期拉伸對(duì)胎膜的作用。它是第一個(gè)確定機(jī)械拉伸對(duì)轉(zhuǎn)錄因子nrf2表達(dá)的影響以及hmgb1分泌和細(xì)胞內(nèi)ros水平變化的，特別是在haecs中（圖5）。先前的工作表明，拉伸會(huì)導(dǎo)致haecs分泌的il-6和pbef增加，因此結(jié)合新數(shù)據(jù)，支持了這種形式的細(xì)胞應(yīng)激刺激可以在羊膜中促炎的一般論點(diǎn)。為了進(jìn)一步支持研究結(jié)果，先前已經(jīng)表明，沉默原代羊膜細(xì)胞中的nrf2會(huì)增加促炎細(xì)胞因子il-6和趨化因子il-8的表達(dá)和分泌。因此，在該研究中，蘿卜硫素對(duì)nrf2降低的拯救表明，nrf2的激活可以被操縱來(lái)產(chǎn)生抗炎和抗氧化過(guò)程，這些過(guò)程對(duì)及時(shí)分娩和健康的妊娠結(jié)果很重要。
參考文獻(xiàn)：padron jg, norman ing nd, ng pk, kendal-wright ce. stretch causes cell stress and the downregulation of nrf2 in primary amnion cells. biomolecules. 2022 may 31;12(6):766. doi: 10.3390/biom12060766. pmid: 35740891; pmcid: pmc9220942.