熒光標(biāo)記所依賴的化合物稱為熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)是指具有共軛雙鍵體系化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，受到紫外光或藍(lán)紫光照射時(shí)，可激發(fā)成為激發(fā)態(tài)，當(dāng)從激發(fā)態(tài)恢復(fù)基態(tài)時(shí)，發(fā)出熒光。熒光標(biāo)記技術(shù)指利用熒光物質(zhì)共價(jià)結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某個(gè)基團(tuán)上，利用它的熒光特性來(lái)提供被研究對(duì)象的信息。熒光標(biāo)記的無(wú)放射物污染，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，使得熒光標(biāo)記物在許多研究領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛。
熒光標(biāo)記物質(zhì)在蛋白的功能研究、藥物篩選等領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用。人們利用利用熒光標(biāo)記的多肽來(lái)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的活性，并將其發(fā)展的高通量活性篩選方法應(yīng)用于疾病治療靶點(diǎn)蛋白的藥物篩選和藥物開(kāi)發(fā)（例如，各種激酶、磷酸酶、肽酶等）。熒光標(biāo)記是非常常用的實(shí)驗(yàn)方法。一般來(lái)講，熒光標(biāo)記染色的目的有3個(gè)：
1、多種蛋白標(biāo)記后，分析蛋白在空間上的分布特征；
2、免疫熒光標(biāo)記后進(jìn)行蛋白半定量分析，分析蛋白半定量表達(dá)量；
3、標(biāo)記細(xì)胞核，以便分析細(xì)胞核數(shù)量，如凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)等。
上方所述的第1條和第3條是熒光標(biāo)記染色的最佳應(yīng)用場(chǎng)景，一般并不推薦將熒光標(biāo)記應(yīng)用于第2條。如果一定要在熒光圖像上進(jìn)行蛋白半定量分析呢？其實(shí)也是有一個(gè)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)，即測(cè)量灰度。
1、灰度的概念應(yīng)用
與wb蛋白條帶分析原理一致，免疫熒光分析也是圍繞灰度進(jìn)行分析。不同的熒光強(qiáng)度本質(zhì)上可以理解成灰度值的差異，因?yàn)樵诜治鰰r(shí)，我們是在同一通道下進(jìn)行比較的。舉個(gè)例子，大家都是紅色的，只是紅色的強(qiáng)度和分布面積不同，這個(gè)強(qiáng)度可以灰度來(lái)代替。再細(xì)化一下灰度概念，我們測(cè)量圖像時(shí)，是為了得到積分灰度值或者平均灰度值。積分灰度值即圖像上目標(biāo)區(qū)域所有像素點(diǎn)的灰度值之和，可以代表目標(biāo)區(qū)域所包含蛋白的總相對(duì)表達(dá)量。
平均灰度值即目標(biāo)區(qū)域積分灰度值除以目標(biāo)區(qū)域面積，可以代表目標(biāo)區(qū)域的平均蛋白表達(dá)量。
個(gè)人認(rèn)為平均灰度值是更適合的測(cè)量指標(biāo)，因?yàn)樗蟹e分灰度值和面積這兩個(gè)指標(biāo)的約束，相較于積分灰度值來(lái)說(shuō)更靠近客觀事實(shí)。
2、通道分割
最簡(jiǎn)dan的免疫熒光標(biāo)記是dapi（藍(lán)）+單通道熒光（紅或綠）。如下
這種是最普通的熒光標(biāo)記，圖像上只有2個(gè)通道激發(fā)光。在分析之前，必須將2個(gè)通道的熒光分割開(kāi)，獲得2張圖像。其實(shí)這就是熒光圖像merge的反向操作。
無(wú)論是image j或者是image pro plus軟件，都內(nèi)置通道分割的功能。因此，實(shí)施起來(lái)還是很簡(jiǎn)單的。
同理，多色熒光標(biāo)記其實(shí)就是多了通道而已，分割方法也是一樣的。
3. 熒光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為灰度
無(wú)論是jpeg格式還是tiff格式的熒光圖像，都是32bit rgb圖，但是灰度圖是8bit黑白圖像。
因此，在進(jìn)行灰度分析之前，必須對(duì)原始彩色圖像進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，最終得到8bit 黑白圖像。常做蛋白條帶分析的人肯定清楚，分析之前，先對(duì)原始圖像去色，然后再轉(zhuǎn)換成8bit黑白圖。熒光圖像的灰度分析，也是這么個(gè)道理。
4、測(cè)量
測(cè)量是很簡(jiǎn)單的。原理是在一定的分割閾值下，選擇測(cè)量參數(shù)為area、mean gray value這兩個(gè)測(cè)量指標(biāo)。
值得一提的是，分割閾值。閾值8bit 黑白圖像中很重要的一個(gè)參數(shù)，它的大小直接決定了目標(biāo)區(qū)域的面積和灰度值。其功能類似于彩色圖像中的γ值。
有經(jīng)驗(yàn)的朋友知道，通過(guò)調(diào)整γ值可以調(diào)整整個(gè)圖像的特征；同一張圖在不同的γ值下，甚至可能變成兩個(gè)wan全不同的圖像。
所以，在進(jìn)行測(cè)量時(shí)，分割閾值是非常值得仔細(xì)斟酌的測(cè)量條件。