特點(diǎn)：
□采用微機(jī)控制并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
□用干涉濾光片作為分光元件，光電管進(jìn)行光電轉(zhuǎn)換。
□具有鉀、鈉濃度直讀，曲線擬合，靈敏度漂移，自動(dòng)校正，自動(dòng)調(diào)滿度?；鹧婺芰恐甘?，操作失誤顯示，打印結(jié)果等功能。
□線性穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，尤其適合臨床應(yīng)用。
技術(shù)指標(biāo)：
□分光方式：干涉濾光片
□顯示方式：雙通道3位數(shù)字讀數(shù)
□量程：k 1mg/l大于100個(gè)度數(shù)；na 1.8mg/l大于100個(gè)讀數(shù)
□精密度：cv≤3％
□溶液耗量：<6ml/min
□阻尼時(shí)間：≤6秒
分光光度計(jì)就是利用分光光度法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器。
而分光光度法則是通過(guò)測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)光的吸收度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。 常用的波長(zhǎng)范圍為：(1)200～400nm的紫外光區(qū),(2)400～760nm的可見(jiàn)光區(qū),(3)2.5～25μm（按波數(shù)計(jì)為4000cm<-1>～400cm<-1>）的紅外光區(qū)。所用儀器為紫外分光光度計(jì)、可見(jiàn)光分光光度計(jì)（或比色計(jì)）、紅外分光光度計(jì)或原子吸收分光光度計(jì)。為保證測(cè)量的精密度和準(zhǔn)確度，所有儀器應(yīng)按照國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程或本附錄規(guī)定，定期進(jìn)行校正檢定。 單色光輻射穿過(guò)被測(cè)物質(zhì)溶液時(shí)，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長(zhǎng)度）成正比，其關(guān)系如下式：
a=-log(i/i。)=-lgt=klc
式中 :a 為吸收度；
i。為入射的單色光強(qiáng)度；
i 為透射的單色光強(qiáng)度；
t 為物質(zhì)的透射比；
k 為吸收系數(shù)；
l 為被分析物質(zhì)的光程
c 為物質(zhì)的濃度
物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收波長(zhǎng)，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后,可用同樣條件將該供試品配成溶液，測(cè)定其吸收度,即可由上式計(jì)算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見(jiàn)光區(qū)，除某些物質(zhì)對(duì)光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒(méi)有吸收,但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過(guò)處理使其顯色后再測(cè)定,故又稱比色分析。由于顯色時(shí)影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測(cè)定時(shí)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吠瑫r(shí)操作。
分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量。儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測(cè)器、信號(hào)處理器和顯示與存儲(chǔ)系統(tǒng)組成。
分光光度計(jì)的簡(jiǎn)單原理
分光光度計(jì)計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源，通過(guò)系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源，光源透過(guò)測(cè)試的樣品后，部分光源被吸收，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率最高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈dna，以及rna。核酸的最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類(lèi)型的核酸，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。如：1od 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsdna，37μg/ml的ssdna，40μg/ml的rna，30μg/ml的olig。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測(cè)試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測(cè)試空白液和樣品液。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者最頭痛的問(wèn)題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實(shí)上，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度。如eppendorf biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1a）。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的ph值，離子濃度等：在測(cè)試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用ph值一定、離子濃度較低的緩沖液，如te，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了最大程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1a，吸光值最好在0.1-1.5a。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對(duì)較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過(guò)低，或者過(guò)高（超過(guò)光度計(jì)的測(cè)試范圍）。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡，空白液無(wú)懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。
除了核酸濃度，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如a260/a280的比值，用于評(píng)估樣品的純度，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品，比值大于1.8（dna）或者2.0（rna）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類(lèi)物質(zhì)的影響。a230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸a260/a230的比值大于2.0。a320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，a320一般是0。
蛋白質(zhì)的直接定量（uv法）
這種方法是在280nm波長(zhǎng)，直接測(cè)試蛋白。選擇warburg 公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程非常簡(jiǎn)單，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm 的“背景”信息，設(shè)定此功能“開(kāi)”。與測(cè)試核酸類(lèi)似，要求a280的吸光值至少大于0.1a，最佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。實(shí)驗(yàn)中選擇warburg 公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上，只要觀察a280的吸光值的變化范圍不超過(guò)1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因?yàn)閣arburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會(huì)被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō)，速度快，操作簡(jiǎn)單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如dna的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質(zhì)定量
蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。
比色方法一般有bca，bradford，lowry 等幾種方法。
lowry 法：以最早期的biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與cu2 反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與biuret 相比，lowry 法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑；反應(yīng)需要的時(shí)間較長(zhǎng)；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含edta，triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。
bca（bicinchoninine acid assay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測(cè)試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與cu2 反應(yīng)產(chǎn)生cu ，后者與bca形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長(zhǎng)。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系極強(qiáng)，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對(duì)于lowry法，操作簡(jiǎn)單，敏感度高。但是與lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。
bradford 法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點(diǎn)是，敏感度好，是lowry 和bca 兩種測(cè)試方法的2 倍；操作更簡(jiǎn)單，速度更快；只需要一種反應(yīng)試劑；化合物可以穩(wěn)定１小時(shí)，方便結(jié)果；而且與一系列干擾lowry，bca 反應(yīng)的還原劑（如dtt，巰基乙醇）相容。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的。最主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無(wú)可比性。
某些初次接觸比色法測(cè)定的研究者可能為各種比色法測(cè)出的結(jié)果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一，所以同時(shí)使用幾種方法對(duì)同一樣品得出的樣品濃度無(wú)可比性。例如：keller等測(cè)試人奶中的蛋白，結(jié)果lowry，bca 測(cè)出的濃度明顯高于bradford，差異顯著。即使是測(cè)定同一樣品，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測(cè)試后的濃度也不一致。如用lowry測(cè)試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以bsa作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類(lèi)似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問(wèn)題是樣品的吸光值太低，導(dǎo)致測(cè)出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問(wèn)題是，反應(yīng)后1011分光光度計(jì)的重要配件—— 比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測(cè)試時(shí)間，所有的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品），都必須在此時(shí)間內(nèi)測(cè)試。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應(yīng)溫度、溶液ph值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確。
細(xì)菌細(xì)胞密度（od 600）
實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長(zhǎng)密度和生長(zhǎng)期，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測(cè)推斷細(xì)菌的生長(zhǎng)密度。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度。od600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對(duì)每種微生物和每臺(tái)儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，做出校正曲線。實(shí)驗(yàn)中偶爾會(huì)出現(xiàn)菌液的od值出現(xiàn)負(fù)值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時(shí)間后，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng)。另外，需要注意的是，測(cè)試的樣品不能離心，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài)。
分光光度計(jì)的重要配件—— 比色杯
比色杯按照材質(zhì)大致分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根據(jù)不同的測(cè)量體積，有比色杯和毛細(xì)比色杯等。一般測(cè)試核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測(cè)定。因?yàn)榉磻?yīng)中的染料（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著色，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內(nèi)測(cè)試樣品。
由于另外測(cè)試的樣品量不同，所以一般分光光度計(jì)廠家提供不同容積的比色杯以滿足用戶不同的需求。目前市場(chǎng)已經(jīng)存在一種既可用于核酸、紫外蛋白質(zhì)定量，亦可用于蛋白比色法測(cè)定的塑料杯，樣品用量?jī)H需50μl，比色杯單個(gè)無(wú)菌包裝，可以回收樣品。如eppendorf uvette®塑料比色杯，是目前比色杯市場(chǎng)上一個(gè)革新。隨著生命科學(xué)以及相關(guān)學(xué)科發(fā)展，對(duì)此類(lèi)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究提出更高的要求，分光光度計(jì)將是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室不可缺少的儀器，也成為微生物、食品、制藥等相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的必備設(shè)備之一。
隨著科技的發(fā)展，現(xiàn)在比色杯已經(jīng)不是使用分光光度計(jì)時(shí)的必備物品。目前國(guó)外nanodrop公司（現(xiàn)已被thermo fisher公司收購(gòu)）生產(chǎn)的nd1000分光光度計(jì)與舊式分光光度計(jì)相比，已經(jīng)可以做到無(wú)需稀釋樣品，無(wú)需使用比色杯，每次測(cè)量?jī)H需1-2μl樣品即可完成測(cè)量。
使用方法：
1.接通電源，打開(kāi)儀器開(kāi)關(guān)，掀開(kāi)樣品室暗箱蓋，預(yù)熱10分鐘。
2.將靈敏度開(kāi)關(guān)調(diào)至“1”檔（若零點(diǎn)調(diào)節(jié)器調(diào)不到“0”時(shí)，需選用較高檔。）
3.根據(jù)所需波長(zhǎng)轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)選擇鈕。
4.將空白液及測(cè)定液分別倒入比色杯3/4處，用擦鏡紙擦清外壁，放入樣品室內(nèi)，使空白管對(duì)準(zhǔn)光路。
5.在暗箱蓋開(kāi)啟狀態(tài)下調(diào)節(jié)零點(diǎn)調(diào)節(jié)器，使讀數(shù)盤(pán)指針指向t=0處。
6.蓋上暗箱蓋，調(diào)節(jié)“100”調(diào)節(jié)器，使空白管的t=100，指針?lè)€(wěn)定后逐步拉出樣品滑竿，分別讀出測(cè)定管的光密度值，并記錄。
7.比色完畢，關(guān)上電源，取出比色皿洗凈，樣品室用軟布或軟紙擦凈。
注意事項(xiàng)：
1、該儀器應(yīng)放在干燥的房間內(nèi)，使用時(shí)放置在堅(jiān)固平穩(wěn)的工作臺(tái)上，室內(nèi)照明不宜太強(qiáng)。熱天時(shí)不能用電扇直接向儀器吹風(fēng)，防止燈泡燈絲發(fā)亮不穩(wěn)定。
2、使用本儀器前，使用者應(yīng)該首先了解本儀器的結(jié)構(gòu)和工作原理，以及各個(gè)操縱旋鈕之功能。在未按通電源之前，應(yīng)該對(duì)儀器的安全性能進(jìn)行檢查，電源接線應(yīng)牢固，通電也要良好，各個(gè)調(diào)節(jié)旋鈕的起始位置應(yīng)該正確，然后再按通電源開(kāi)關(guān)。
3、在儀器尚未接通電源時(shí)，電表指針必須于“0”刻線上，若不是這種情況，則可以用電表上的校正螺絲進(jìn)行調(diào)節(jié)。