實驗材料
?bsa（1 mg/ml），0.05 g的bsa(sigma-aldrich ltd.)溶于50ml ddh2o中，每eppendorf管約加入1ml溶液，并在-20℃下冷凍。
?預染色marker (bio-rad)
?promarker(wealtec)
?兩套玻璃板與校正卡，厚玻璃板與u形玻璃板，0.75 mm厚膠條和一個0.75 mm 10齒梳（wealtec）
?濃度為12％的sds-page分離膠（0.75 mm）;2.31 ml ddh2o，2.8 ml濃度為30％的acrylamide/bis（29:1）(bio-rad)，1.75 ml的1.5m tris-cl，ph 8.8(sigma-aldrich ltd.)，70 μl濃度為10％的sds(bio-rad)，70 μl 10 ％aps(bio-rad)，2.8μl temed(bio-rad)
?5％sds-page濃縮膠（0.75 mm）; 1.7 ml ddh 2 o，0.415 ml 濃度為30％的acrylamide/bis（29:1）（bio-rad），0.315 ml的1m tris-cl，ph值為6.8（sigma），25 μl濃度為10％的sds（bio-rad），25 μl濃度為10 ％的aps（bio-rad），2.5 μl的temed（bio-rad）
?10x tris-glycine緩沖液（sigma）
?v-ges灌膠模具（wealtec）
?v-ges電極與電泳槽（wealtec）
?制冷恒溫金屬?。╳ealtec）
?恒溫金屬?。╳ealtec）
?膠鏟（wealtec）
?考馬斯藍染色緩沖液（濃度為0.1％的考馬斯亮藍 r-250（bio-rad）溶于水/甲醇/乙酸（比例: 45:45:10）混合液中）
?脫色緩沖液（水/甲醇/乙酸（比例:45:45:10））
?配有紫外/白光轉(zhuǎn)換板的dolphin doc凝膠成像系統(tǒng)（wealtec)
步驟
灌膠并將膠塊置入電極中：
?灌膠之前，用75％的乙醇擦試玻璃板和膠條。向上抬起翼型扳手打開灌膠模具，并將模塊水平放置到臺面。將玻璃板和膠條按順序放入v-ges灌膠模具中（圖 2）。
?記得將校正卡恰當?shù)夭迦牒癫ＡО迮cu形玻璃板之間的空隙，以確保膠條插入位置準確。合攏灌膠模具后并直立放置，雙手均勻用力向下扣住翼型扳手以關(guān)閉灌膠模具。若位置正確，校準卡應(yīng)該可以正常上下抽拉活動而不被夾在膠條與玻璃板之間。（圖3- 5）
?用5 ml分離膠溶液（圖 6）制備濃度為12％的sds-page凝膠，然后用移液管將1 ml乙醇滴入裝好的灌膠模具中。等候60分鐘使凝膠聚合。當把溶液倒入玻璃板夾層之間時，將移液管嘴直接置于玻璃板之間，緩慢地滴出液體，盡量避免形成氣泡。凝膠完成聚合后，移除乙醇，將制備好的濃縮膠溶液倒入到分離膠上。輕輕將0.75 mm 10孔梳子插入玻璃板之間。確保無氣泡產(chǎn)生（圖 7）。讓濃縮膠聚合60分鐘。
?在900 ml蒸餾水中稀釋100 ml 10 x緩沖液，并添加sds, 制成zui后濃度為3.5mm的 sds-page電泳緩沖液。
?將兩個翼型扳手均勻施力掰開，從灌膠模具中取出凝膠三明治夾。通過灌膠模具背后留的兩個大孔，輕輕向上將三明治夾推出（圖 8）。
?將電極放入垂直電泳槽內(nèi)。貼著電極壁，將凝膠三明治夾垂直方向插入電極中（圖 9）。
?把凝膠三明治夾置于合適的位置后，關(guān)閉電極門（圖10）。
?如只運行一塊凝膠，則需要把膠門（很厚的玻璃板）插入到電極空著的一邊。將sds-page電泳緩沖液倒入凝膠三明治夾與膠門之間，直到緩沖液表面距離玻璃板上緣1cm（圖 11）。檢查是否有滲漏。將1升的sds-page電泳緩沖液倒入槽內(nèi)凝膠組件的周圍。
樣品制備和裝載：
?將試管插入至制冷恒溫金屬浴（4℃），以解凍冷凍牛血清白蛋白（bsa）（1 mg/ml）樣品。 然后，加入25μl 4x蛋白染料及75 μl的已解凍牛血清白蛋白溶液。
?把樣品加樣到凝膠中前, 請在恒溫金屬浴中以95℃的溫度煮沸混合好的 bsa樣品、預染標記和 promarker，5分鐘。
?向凝膠中裝載樣品前，用100μl的移液器輕輕抽放緩沖液沖洗井孔讓樣品孔更平滑。在把樣品放入凝膠前，做簡單離心與混勻保證蛋白溶液濃度不變。在每個孔中注入10μl的蛋白質(zhì)樣品（圖 12）。
?將安全蓋安裝到槽頂部，并將電極導線連接至電源（圖 13）。
?開始電泳：90 v運行60分鐘，130v再運行60分鐘。
?電泳后，將膠鏟插入到兩玻璃板之間，輕輕來回撬動直到兩板分開，把凝膠從玻璃板上移除（圖 14）。 除去上層膠，用考馬斯亮藍溶液染色下層分離膠15分鐘。
?將凝膠置于脫色緩沖液過夜震蕩進行脫色。
?通過dolphin-doc凝膠成像分析系統(tǒng)的紫外/白光轉(zhuǎn)換板拍照。
結(jié)果
圖1. 電泳后的凝膠。左邊外側(cè)孔裝載預染色marker，右邊兩個外側(cè)泳道裝載pro-marker。中間的孔裝載1 mg/ml的牛血清白蛋白 (bsa)。濃縮膠部分已被除去。
備注
?在12％的分離膠中用恒定電壓輸出設(shè)置對樣品進行分離, bsa（66.2 kda）被地分離到相對于預染色marker（bio-rad）在凝膠中的遷移的位置。
?在制作下層分離膠的同時，將溶液注入玻璃板后, 請使用etoh溶液或蒸餾水將凝膠處理平整。否則，外道的蛋白質(zhì)會傾向于向一側(cè)偏斜。
?分離小體積、或者大小體積的蛋白質(zhì)/多肽時，可能需要使用不同凝膠濃度、分離時間和電壓設(shè)置。除了向蛋白質(zhì)樣品添加諸如熒光蛋白染色劑等添加劑外，混合物也可能改變蛋白質(zhì)的遷移特性。
?實驗者在組裝玻璃板和膠條的過程中務(wù)必格外小心。若膠條放置不當，可能導致漏膠。使用校準卡可以更方便地找到膠條的正確位置。
?組裝好灌膠模具之后，可在倒入制膠溶液之前, 用移液管往玻璃板夾層注水, 并等待約5分鐘，以測試是否有滲漏。