細菌呼吸鏈復(fù)合物3（bc-1 complex）活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書
（中文版）
主要用途
細菌呼吸鏈復(fù)合物3（bc-1 complex）活性光度法定量檢測試劑是一種旨在使用還原性合成輔酶q同功類似物和特異性抑制劑，通過反應(yīng)系統(tǒng)測定樣品中細胞色素c還原后峰值的增高，即采用比色法測定樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種野生、培養(yǎng)或病原性細菌膜蛋白懸液樣品的輔酶q-細胞色素c還原酶的特異性活性檢測。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。
技術(shù)背景
細菌呼吸鏈復(fù)合物iii，通常稱為輔酶q－細胞色素c還原酶、細胞色素還原酶或bc1復(fù)合物（ubiquinol cytochrome c oxidoreductase；cytochrome reductase；bc1 complex），是細菌電子傳遞鏈的中心元素，位于革蘭氏陰性和陽性細菌（除大腸桿菌和古生菌等），包括光合成細菌的細胞膜上，為寡聚體膜蛋白復(fù)合物。細菌使用氧氣、氮、硫化物等作為終端電子受體。細菌復(fù)合物iii含有三個亞單位，包括細胞色素b（cytochrome b），細胞色素c1（cytochrome c1）和rieske鐵硫蛋白（rieske iron-sulfur protein），通過q循環(huán)（q cycle）進行催化作用。其特征性的酶活性是抗霉素敏感的輔酶q－細胞色素c還原酶。復(fù)合物iii催化氧化型細胞色素c被還原為還原型細胞色素c，細菌內(nèi)電子由低電位的供體還原型泛醌（ubiquinol；uqh2）或還原型輔酶q（reduced coenzyme q；coqh2）傳遞到細胞色素c或質(zhì)體藍素（plastocyanin）上的能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)，進行呼吸鏈傳遞。細菌復(fù)合物3和復(fù)合物4的相互作用，形成泛醌氧化酶（quinol oxidase）。輔酶q－細胞色素c還原酶反應(yīng)系統(tǒng)測定氧化型細胞色素c的濃度變化?；谶€原型泛醌或還原型輔酶q底物，在抗霉素存在與否的情況下，通過輔酶q-細胞色素c還原酶的催化，轉(zhuǎn)化成泛醌（ubiquinone；uq）或輔酶q（coenzyme q；coq），同時氧化型細胞色素c，轉(zhuǎn)化為還原型細胞色素c，在分光光度儀下產(chǎn)生吸光峰值的變化（550nm 波長），由此定量測定輔酶q－細胞色素c還原酶的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)是：
complex iii
coqh2+2 ferricyt c3++2h+→coq + 2 ferrocyt c2++4h+
↓abs 550 nm ↑abs 550 nm
產(chǎn)品內(nèi)容
緩沖液（reagent a） 20毫升
反應(yīng)液（reagent b） 125微升
陰性液（reagent c） 2毫升
底物液（reagent d） 500微升
專性液（reagent e） 200微升
穩(wěn)定液a（reagent f1） 4管
穩(wěn)定液b（reagent f2） 5毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；反應(yīng)液（reagent b）和底物液（reagent d），避免光照，有效保證3月
用戶自備
比色皿：用于比色的容器
分光光度儀：用于比色分析
培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；反應(yīng)液（reagent b）和底物液（reagent d）注意避光。
一、測定準備
1．準備好待測樣品（例如細菌膜蛋白樣品等），置于冰槽里
2．設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為550nm，間隔60秒，讀數(shù)3次（共2分鐘），并置零
3．緩沖液（reagent a）室溫下均衡溫度
4．實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的穩(wěn)定液b（reagent f2）置入冰槽里融化，然后移出1毫升到穩(wěn)定液a（reagent f1）管里，混勻后，標記為穩(wěn)定工作液，置于冰槽里備用（注意，15分鐘內(nèi)使用，用完后丟棄）。然后將－20℃冰箱里的試劑盒中的反應(yīng)液（reagent b）室溫下融化，然后移出10微升到新的1.5毫升離心管，加入10微升穩(wěn)定工作液，輕柔混勻后，室溫下避光靜置15分鐘（可見顏色變白），標記為反應(yīng)工作液。然后即刻進行下列操作。
二、背景對照測定
1．移取870微升緩沖液（reagent a）到新的比色皿
2．加入10微升反應(yīng)工作液
3．加入20微升底物液（reagent d）
4．室溫下靜置10分鐘，避免光照
5．加入100微升陰性液（reagent c）
6．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
7．即刻放入分光光度儀檢測，此為背景空對照：550波長讀數(shù)1分鐘或2分鐘－550波長讀數(shù)0分鐘
三、樣品總活性測定
1．移取870微升緩沖液（reagent a）到新的比色皿
2．加入10微升反應(yīng)工作液
3．加入20微升底物液（reagent d）
4．室溫下靜置10分鐘，避免光照
5．加入100微升待測樣品（注意：15微克細菌膜蛋白）
6．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
7．即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：550波長讀數(shù)1分鐘或2分鐘－550波長讀數(shù)0分鐘
四、樣品非特異活性測定
1．移取850微升緩沖液（reagent a）到新的比色皿
2．加入10微升反應(yīng)工作液，避免光照
3．加入20微升底物液（reagent d）
4．室溫下靜置10分鐘，避免光照
5．加入20微升專性液（reagent e）
6．加入100微升待測樣品（注意：15微克細菌膜蛋白）
7．上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
8．即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：550波長讀數(shù)1分鐘或2分鐘－550波長讀數(shù)0分鐘
五、計算樣品活性
1）樣品活性（總活性和非特異活性）
【（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）x 1（體系容量；毫升）x樣品稀釋倍數(shù)】÷【0.1（樣品容量；毫升）x 21.84（毫摩爾吸光系數(shù)x 1或2（反應(yīng)時間；分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾coqh2（還原型泛醌）/分鐘
2）樣品特異活性
樣品總活性－樣品非特異活性＝樣品特異活性
毫克/毫升＝單位/毫克
注意事項
1．本產(chǎn)品為21次操作（10個樣本），包括1次背景對照測定
2．操作時，須戴手套
3．系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
4．如果增強酶活檢測，建議使用細菌膜蛋白樣品。推薦使用細菌呼吸鏈復(fù)合物檢測樣品制備試劑盒－15142
5．每增加1個樣品，增加反應(yīng)工作液為：反應(yīng)液（reagent b）5微升＋穩(wěn)定工作液5微升，以此類推。配制反應(yīng)工作液時，須根據(jù)樣本數(shù)量配制實際工作液容量
6．用戶可以根據(jù)實際樣品，計算緩沖液（reagent a）、反應(yīng)工作液和底物液（reagent d）三者之和，混勻后，室溫下靜置10分鐘后，即刻檢測
7．加入樣品啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻比色測定
8．分光光度計波長嚴格設(shè)置在550nm，誤差10nm將不產(chǎn)生信號
9．測定可以持續(xù)2分鐘
10．測定值由低到高變化，即2分鐘測定讀數(shù)高于0分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性
11．比色測定后，比色皿須清洗*
12．建議用戶使用分光光度儀檢測，總體系減半可以增加檢測樣本數(shù)
13．建議待測樣本膜蛋白濃度為15微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調(diào)整（本公司提供bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
14．如果使用細菌裂解懸液，則蛋白濃度為50微克/100微升
15．樣品特異活性是指抗霉素敏感的輔酶q－細胞色素c還原酶，去除其它干擾因素（例如復(fù)合物i/ii/iv等）
16．細菌呼吸鏈復(fù)合物iii（輔酶q－細胞色素c還原酶）單位活性定義為：在30℃，ph 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型泛醌（coqh2）所需的酶量作為一個活性單位
17．本公司提供系列細菌酶類技術(shù)產(chǎn)品
質(zhì)量標準
1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準確