色譜法 chromatography
色譜法又稱“色譜分析”、“色譜分析法”、“層析法”，是一種分離和分析方法，在分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用。色譜法利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，以流動(dòng)相對(duì)固定相中的混合物進(jìn)行洗脫，混合物中不同的物質(zhì)會(huì)以不同的速度沿固定相移動(dòng)，最終達(dá)到分離的效果。色譜法起源于20世紀(jì)初，1950年代之后飛速發(fā)展，并發(fā)展出一個(gè)獨(dú)立的三級(jí)學(xué)科-色譜學(xué)。歷史上曾經(jīng)先后有兩位化學(xué)家因?yàn)樵谏V領(lǐng)域的突出貢獻(xiàn)而獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，此外色譜分析方法還在12項(xiàng)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的研究工作中起到關(guān)鍵作用。歷史色譜法從二十世紀(jì)初發(fā)明以來，經(jīng)歷了整整一個(gè)世紀(jì)的發(fā)展到今天已經(jīng)成為最重要的分離分析科學(xué)，廣泛地應(yīng)用于許多領(lǐng)域，如石油化工、有機(jī)合成、生理生化、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)，乃至空間探索等。 將一滴含有混合色素的溶液滴在一塊布或一片紙上，隨著溶液的展開可以觀察到一個(gè)個(gè)同心圓環(huán)出現(xiàn)，這種層析現(xiàn)象雖然古人就已有初步認(rèn)識(shí)并有一些簡單的應(yīng)用，但真正首先認(rèn)識(shí)到這種層析現(xiàn)象在分離分析方面具有重大價(jià)值的是俄國植物學(xué)家tswett。 tswett關(guān)于色譜分離方法的研究始于1901年，兩年后他發(fā)表了他的研究成果"一種新型吸附現(xiàn)象及其在生化分析上的應(yīng)用，提出了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法。三年后，他將這種方法命名為色譜法（chromatography），很顯然色譜法 （chromatography）這個(gè)詞是由顏色（chrom）和圖譜(graph)這兩個(gè)詞根組成的，派生詞有chromatograph（色譜儀），chromatogram（色譜圖），chromatographer（色譜工作者）等。由于tswett的開創(chuàng)性工作，因此人們尊稱他為"色譜學(xué)之父"，而以他的名字命名的tswett獎(jiǎng)也成為了色譜界的最高榮譽(yù)獎(jiǎng)。 色譜法發(fā)明后的最初二三十年發(fā)展非常緩慢。液-固色譜的進(jìn)一步發(fā)展有賴于瑞典科學(xué)家tiselius（1948年nobel chemistry prize獲得者）和claesson的努力，他們創(chuàng)立了液相色譜的迎頭法和頂替法。分配色譜是由著名的英國科學(xué)家martin和synge創(chuàng)立的，他們因此而獲得1952年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1941年，martin和synge采用水分飽和的硅膠為固定相，以含有乙醇的氯仿為流動(dòng)相分離乙?；被幔麄?cè)谶@一工作的論文中預(yù)言了用氣體代替液體作為流動(dòng)相來分離各類化合物的可能性。 1951年，martin和james報(bào)道了用自動(dòng)滴定儀作檢測器分析脂肪酸，創(chuàng)立了氣-液色譜法；1958年，golay首先提出了分離效能極高的毛細(xì)管柱氣相色譜法，發(fā)明了玻璃毛細(xì)管拉制機(jī)，從此氣相色譜法超過最先發(fā)明的液相色譜法而迅速發(fā)展起來，今天常用的氣相色譜檢測器也幾乎是在五十年代發(fā)展起來的。七十年代發(fā)明了石英毛細(xì)管柱和固定液的交聯(lián)技術(shù)。隨著電子技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展氣相色譜儀器也在不斷發(fā)展完善中，到現(xiàn)在最先進(jìn)的氣相色譜儀已實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)化和計(jì)算機(jī)控制，并可通過網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程診斷和控制。色譜的起源 色譜法起源于20世紀(jì)初，1906年俄國植物學(xué)家米哈伊爾·茨維特用碳酸鈣填充豎立的玻璃管，以石油醚洗脫植物色素的提取液，經(jīng)過一段時(shí)間洗脫之后，植物色素在碳酸鈣柱中實(shí)現(xiàn)分離，由一條色帶分散為數(shù)條平行的色帶。由于這一實(shí)驗(yàn)將混合的植物色素分離為不同的色帶，因此茨維特將這種方法命名為хроматография，這個(gè)單詞最終被英語等拼音語言接受，成為色譜法的名稱。漢語中的色譜也是對(duì)這個(gè)單詞的意譯。
茨維特并非著名科學(xué)家，他對(duì)色譜的研究以俄語發(fā)表在俄國的學(xué)術(shù)雜志之后不久，第一次世界大戰(zhàn)爆發(fā)，歐洲正常的學(xué)術(shù)交流被迫終止。這些因素使得色譜法問世后十余年間不為學(xué)術(shù)界所知，直到1931年德國柏林威廉皇帝研究所的庫恩將茨維特的方法應(yīng)用于葉紅素和葉黃素的研究，庫恩的研究獲得了廣泛的承認(rèn)，也讓科學(xué)界接受了色譜法，此后的一段時(shí)間內(nèi)，以氧化鋁為固定相的色譜法在有色物質(zhì)的分離中取得了廣泛的應(yīng)用，這就是今天的吸附色譜。分配色譜的出現(xiàn)和色譜方法的普及 1938年阿切爾·約翰·波特·馬丁和理查德·勞倫斯·米林頓·辛格準(zhǔn)備利用氨基酸在水和有機(jī)溶劑中的溶解度差異分離不同種類的氨基酸，馬丁早期曾經(jīng)設(shè)計(jì)了逆流萃取系統(tǒng)以分離維生素，馬丁和辛格準(zhǔn)備用兩種逆向流動(dòng)的溶劑分離氨基酸，但是沒有獲得成功。后來他們將水吸附在固相的硅膠上，以氯仿沖洗，成功地分離了氨基酸，這就是現(xiàn)在常用的分配色譜。在獲得成功之后，馬丁和辛格的方法被廣泛應(yīng)用于各種有機(jī)物的分離。1943年馬丁以及辛格又發(fā)明了在蒸汽飽和環(huán)境下進(jìn)行的紙色譜法。氣相色譜和色譜理論的出現(xiàn) 1952年馬丁和詹姆斯提出用氣體作為流動(dòng)相進(jìn)行色譜分離的想法，他們用硅藻土吸附的硅酮油作為固定相，用氮?dú)庾鳛榱鲃?dòng)相分離了若干種小分子量揮發(fā)性有機(jī)酸。
氣相色譜的出現(xiàn)使色譜技術(shù)從最初的定性分離手段進(jìn)一步演化為具有分離功能的定量測定手段，并且極大的刺激了色譜技術(shù)和理論的發(fā)展。相比于早期的液相色譜，以氣體為流動(dòng)相的色譜對(duì)設(shè)備的要求更高，這促進(jìn)了色譜技術(shù)的機(jī)械化、標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化；氣相色譜需要特殊和更靈敏的檢測裝置，這促進(jìn)了檢測器的開發(fā)；而氣相色譜的標(biāo)準(zhǔn)化又使得色譜學(xué)理論得以形成色譜學(xué)理論中有著重要地位的塔板理論和van deemter方程，以及保留時(shí)間、保留指數(shù)、峰寬等概念都是在研究氣相色譜行為的過程中形成的。高效液相色譜 1960年代，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易汽化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代末科克蘭、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺(tái)高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時(shí)代。高效液相色譜使用粒徑更細(xì)的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數(shù)，以高壓驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相，使得經(jīng)典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)月完成的分離工作得以在幾個(gè)小時(shí)甚至幾十分鐘內(nèi)完成。
1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實(shí)踐》一書，標(biāo)志著高效液相色譜法 （hplc）正式建立。在此后的時(shí)間里，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測手段，在有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)與檢測、化工、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應(yīng)用。高效液相色譜同時(shí)還極大的刺激了固定相材料、檢測技術(shù)、數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及色譜理論的發(fā)展。分類按兩相狀態(tài) 氣相色譜法
·氣固色譜法
·氣液色譜法
液相色譜法
·液固色譜法
·液液色譜法
按固定相的幾何形式 ·柱色譜法(column chromatography)
柱色譜法是將固定相裝在一金屬或玻璃柱中或是將固定相附著在毛細(xì)管內(nèi)壁上做成色譜柱，試樣從柱頭到柱尾沿一個(gè)方向移動(dòng)而進(jìn)行分離的色譜法。
·紙色譜法（paper chromatography）
紙色譜法是利用濾紙作固定液的載體，把試樣點(diǎn)在濾紙上，然后用溶劑展開，各組分在濾紙的不同位置以斑點(diǎn)形式顯現(xiàn)，根據(jù)濾紙上斑點(diǎn)位置及大小進(jìn)行定性和定量分析。
·薄層色譜法(thin-layer chromatography, tlc)
薄層色譜法是將適當(dāng)粒度的吸附劑作為固定相涂布在平板上形成薄層，然后用與紙色譜法類似的方法操作以達(dá)到分離目的。
按分離原理
按色譜法分離所依據(jù)的物理或物理化學(xué)性質(zhì)的不同，又可將其分為：
吸附色譜法：利用吸附劑表面對(duì)不同組分物理吸附性能的差別而使之分離的色譜法稱為吸附色譜法。適于分離不同種類的化合物（例如，分離醇類與芳香烴）。
分配色譜法：利用固定液對(duì)不同組分分配性能的差別而使之分離的色譜法稱為分配色譜法。
離子交換色譜法：利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法，利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差異來實(shí)現(xiàn)分離。離子交換色譜主要是用來分離離子或可離解的化合物。它不僅廣泛地應(yīng)用于無機(jī)離子的分離，而且廣泛地應(yīng)用于有機(jī)和生物物質(zhì)，如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等的分離。
尺寸排阻色譜法：是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法，體積大的分子不能滲透到凝膠孔穴中去而被排阻，較早的淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本按其分子大小先后排阻，從柱中流出。被廣泛應(yīng)用于大分子分級(jí)，即用來分析大分子物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的分布。
親和色譜法：相互間具有高度特異親和性的二種物質(zhì)之一作為固定相，利用與固定相不同程度的親和性，使成分與雜質(zhì)分離的色譜法。例如利用酶與基質(zhì)（或抑制劑）、抗原與抗體，激素與受體、外源凝集素與多糖類及核酸的堿基對(duì)等之間的專一的相互作用，使相互作用物質(zhì)之一方與不溶性擔(dān)體形成共價(jià)結(jié)合化合物，用來作為層析用固定相，將另一方從復(fù)雜的混合物中選擇可逆地截獲，達(dá)到純化的目的。可用于分離活體高分子物質(zhì)、過濾性病毒及細(xì)胞。或用于對(duì)特異的相互作用進(jìn)行研究。原理色譜過程的本質(zhì)是待分離物質(zhì)分子在固定相和流動(dòng)相之間分配平衡的過程，不同的物質(zhì)在兩相之間的分配會(huì)不同，這使其隨流動(dòng)相運(yùn)動(dòng)速度各不相同，隨著流動(dòng)相的運(yùn)動(dòng)，混合物中的不同組分在固定相上相互分離。根據(jù)物質(zhì)的分離機(jī)制，又可以分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜、親和色譜等類別。吸附色譜 吸附色譜利用固定相吸附中心對(duì)物質(zhì)分子吸附能力的差異實(shí)現(xiàn)對(duì)混合物的分離，吸附色譜的色譜過程是流動(dòng)相分子與物質(zhì)分子競爭固定相吸附中心的過程
吸附色譜的分配系數(shù)表達(dá)式如下：
k_a =\frac{[x_a]}{[x_m