好的引物會讓pcr實驗成功一半，因而，引物設(shè)計一直都是pcr非常重要的環(huán)節(jié)。經(jīng)典之法就是讓premier5攜手oligo，共同設(shè)計pcr引物。1、以小鼠的il-17為例，進入ncbi界面,選擇nucleotide后，輸入il-17，點擊search。然后選擇人類il-17的mrna，在cds選項中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的origin中，選定目的序列。2、打開primerpremier5軟件，點擊菜單欄file|new|dnasequence，在出現(xiàn)的對話框里黏貼目的序列，并在paste對話框里選擇asis，點擊ok。3、點擊primer，彈出菜單后點擊search按鈕。在彈出的searchcriteria中，選擇pcrprimers，pairs參數(shù)，并選擇所需pcr產(chǎn)物長度，點擊ok。在彈出的search progress菜單中，點擊ok。4、在搜索出的結(jié)果列表里選擇rating值高，bug較少的引物#1，在primerpremier中選擇s（正義鏈）/a（反義鏈），點擊editprimer，將所得引物改成為rating值為100，無bug的引物，即無發(fā)夾（hairpin）、無二聚體（dimer）、無錯配（falsepriming）和交叉配對（crossdimer）的引物。點擊acceptandquit命令即可。5、點擊菜單欄中edit∣copy∣senseprimer/anti-senseprimer，即可得到設(shè)計的引物。6、接下來，就要用oligo軟件驗證評估premier5軟件所設(shè)計的引物，單擊菜單欄里file∣newsequence可打開以下窗口，并將設(shè)計好的上游引物黏貼在空白框里。7、點擊菜單欄里accept/discard中的accept，則會出現(xiàn)tm、△g和frq三個窗口,△g值反應(yīng)了序列與模板的結(jié)合強度，最好引物的△g值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對較低。8、點擊菜單欄里的select中的upperprimer將當(dāng)前引物設(shè)置為上游引物。同時點擊菜單欄里的edit中的“l(fā)owerprimer”命令，在editlower窗口中輸入下游引物的序列。點擊acceptandquit命令即可。9、最后，在菜單欄中analyze完成引物△g值、tm值、引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的分析后，可將引物序列送至公司進行合成即可。
深圳安培生物科技有限公司，是一家具有核心的技術(shù)實力、壹流的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)。總部設(shè)在廣東，服務(wù)面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供壹流的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線，在各個領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供世界前沿水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機構(gòu)、高等院校等優(yōu)質(zhì)客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。