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關(guān)于PCR常見問題與解決方法!

發(fā)布時間:2024-07-11
01、pcr產(chǎn)物的電泳檢測時間
一般為48h以內(nèi),有些最好于當(dāng)日電泳檢測,大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。
02、假陰性,不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
pcr反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備②引物的質(zhì)量與特異性③酶的質(zhì)量及活性 ④pcr循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
一、模板
1、模板中含有雜蛋白質(zhì)
2、模板中含有taq酶抑制劑
3、模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈,特別是染色體中的組蛋白
4、在提取制備模板時丟失過多,或吸入酚
5、模板核酸變性不徹di。在酶和引物質(zhì)量好時,不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,極有可能是標(biāo)本的消化處理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。
二、酶失活
需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加taq酶或溴乙錠。
三、引物
引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是pcr失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴(kuò)增,對策為:
①選定一個好的引物合成單位。
②引物的濃度不僅要看od值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做pcr有可能失敗,應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度。
③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。
④引物設(shè)計不合理,如引物長度不 夠,引物之間形成二聚體等。
四、mg2+濃度
mg2+離子濃度對pcr擴(kuò)增效率影響很大,濃度過高可降低pcr擴(kuò)增的特異性,濃度過低則影響pcr擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使pcr擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
五、反應(yīng)體積的改變
通常進(jìn)行pcr擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul.或100ul,應(yīng)用多大體積進(jìn)行pcr擴(kuò)增,是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定,在做小體積如20ul后,再做大體積時,一定要模索條件,否則容易失敗。
六、物理原因
變性對pcr擴(kuò)增來說相當(dāng)重要,如變性溫度低,變性時間短,極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低pcr擴(kuò)增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計,檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,這也是pcr失敗的原因之一。
七、靶序列變異
如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其pcr擴(kuò)增是不會成功的。
03、假陽性
出現(xiàn)的pcr擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時其條帶更整齊,亮度更高。
一、引物設(shè)計不合適
選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行pcr擴(kuò)增時,擴(kuò)增出的pcr產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。
二、靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染
這種污染有兩種原因:一是整個基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽性。
這種假陽性可用以下方法解決:
①操作時應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。
②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或 器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。
③必要時,在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性??苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后,可擴(kuò)增出pcr產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,可用巢式pcr方法來減輕或消除。
04、出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
pcr擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致,或大或小,或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不wan全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及pcr循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。
其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。
其對策有:
①必要時重新設(shè)計引物。
②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。
③降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。
④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。
出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
pcr擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差,dntp濃度過高,mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多引起。
其對策有:
①減少酶量,或調(diào)換另一來源的酶。
②減少dntp的濃度。
③適當(dāng)降低mg2+濃度。
④增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。
當(dāng)pcr結(jié)果不甚滿意時,首先檢查以下幾方面并遵照執(zhí)行:
1、將pcr反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。
2、當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70℃“熱啟動”開始循環(huán)時,切記在加入酶后稍微振蕩一下,因為在0.2-ml的pcr管中不能均勻傳熱。
3、不要隨意減少dntp的用量,它是一個系統(tǒng)的因素,必須與其它成份保持平衡。
4、對于有問題的pcr反應(yīng),例如模板的量少,模板不純和環(huán)狀模板等,先嘗試加taq酶前的體系進(jìn)行預(yù)變性,后加模板進(jìn)行正常pcr擴(kuò)增。
沒有擴(kuò)增產(chǎn)物:
1、在提供mgcl 2 緩沖液中,以0.25mmol/l為梯度增加mgcl 2 濃度;無mgcl2的緩沖液以0.5 mmol/l為梯度增加mgcl2濃度。
2、泳道中出現(xiàn)模糊條帶,如果dna模板中存在rna,則按上述提示濃度補(bǔ)加mgcl 2 ,因為在pcr反應(yīng)中可能缺少游離的mg 2+ 。
3、檢查退火溫度和變性條件,如果有需要的話,可降低退火溫度。
4、檢查模板和引物的用量。
5、增加循環(huán)次數(shù)和/或模板dna的用量。
泳道中出現(xiàn)模糊條帶:
1、減少循環(huán)次數(shù)或模板dna的用量。
2、提高退火溫度,但不要超過68℃。
3、重新設(shè)計引物或設(shè)計更長的引物。
其他值得注意的條件:
1、建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃時不能有效地使模板變性。
2、最佳反應(yīng)體積為50ml,推薦用30ml礦物油覆蓋(對蓋子加熱的pcr儀可以不加)。
3、大多數(shù)反應(yīng)中,0.75ml(0.5~1ml)的酶量在大多數(shù)情況下可以得到滿意的結(jié)果。
4、優(yōu)化mg2+的濃度是必需的。
5、基因組dna模板的質(zhì)量顯著影響pcr反應(yīng)。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測dna的長度。dna片段長度可以超過50kb,傳統(tǒng)的基因組dna能擴(kuò)增片段至10kb。
6、要擴(kuò)增更長的片段應(yīng)使用超純或高分子量的dna。請查閱高分子量dna提取操作過程相關(guān)文獻(xiàn)。
7、降低二級結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性。進(jìn)行長片段pcr擴(kuò)增時,引物長度一般為24~34個核苷酸,溶點在60~68℃間。使用這類引物可提高pcr反應(yīng)的退火溫度來增加反應(yīng)的特異性。這點非常重要,長片段擴(kuò)增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴(kuò)增的影響。
8、變性:第一步變性在94℃下進(jìn)行2分鐘。在循環(huán)過程中盡可能縮短變性時間(94℃下進(jìn)行20--30秒),除非模板中富含gc,則95℃下變性30秒。這可以防止dna脫嘌啉和鏈斷裂,對于所需擴(kuò)增的基因組dna片段終長度超過12 kb時,應(yīng)該盡可能的降低變性溫度。
9、延伸:68--72℃下進(jìn)行延伸操作。
10、循環(huán)延伸:盡量采用循環(huán)延伸的條件,若pcr儀無此功能,則必須增加延伸的時間,例如在擴(kuò)增10kb片斷時,延伸時間用10分鐘替代原來的8分鐘。
11、長片斷pcr系統(tǒng)擴(kuò)增的片斷其3’-末端帶有一個突出的a,因此建議采用t/a克隆。若要進(jìn)行平端可隆,可用klenow酶和t4 dna多聚酶將pcr產(chǎn)物補(bǔ)平后再進(jìn)行。
12、測序時因酶的混合物帶有3’→5’外切酶活性,用sanger方法進(jìn)行測序不能產(chǎn)生均一的(染色體)帶型。
引物設(shè)計:
1、一般長度20-30bp;
2、至少50%的gc含量;
3、避免引物二聚體和二級結(jié)構(gòu);
4、引物對的tm值應(yīng)該接近。
上一個:污水提升器的性能的參數(shù)指標(biāo)有哪些?
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