一、免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry,ihc）
1、原理和特點
? 原理：利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理和特殊的標(biāo)記技術(shù)，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體顯色，對組織細(xì)胞內(nèi)的特異性抗原進行定位、定性、定量檢測的一門技術(shù)。
? 特點：免疫組化具有操作簡單，特異性強，敏感性高，定位準(zhǔn)確，形態(tài)與功能相結(jié)合等特點。
2、示意圖：
辣根過氧化物酶（hrp）
3、常見問題分析：
a.顯色過深
? 一抗?jié)舛冗^高或孵育時間過長，建議降低一抗?jié)舛然驕p少孵育時間。
? 孵育溫度過高，建議室溫或4℃孵育。
? hrp標(biāo)記二抗孵育時間過長，建議縮短時間。
b. 非特異性顯色
? 石蠟切片脫蠟不*，建議延長脫蠟時間。
? 操作過程中沖洗不充分，建議增加沖洗的次數(shù)與沖洗時間。
? 組織富含內(nèi)源性的*與過氧化物酶，建議使用相關(guān)試劑進行封閉。
? 發(fā)生抗原異位。
? 蛋白封閉不充分，建議增加蛋白封閉時間。
c. 顯色強度弱
? 一抗?jié)舛冗^低或孵育時間過短，建議增加一抗?jié)舛然蜓娱L孵育時間。
? 試劑超過保質(zhì)期，建議實驗前確認(rèn)試劑的保質(zhì)期。
操作過程沖洗過度，建議適度沖洗。
d. 無染色
? 組織中無目的抗原的表達。
? 一抗種屬來源與二抗不匹配，建議實驗前確認(rèn)一抗的種屬來源。
? 顯色物質(zhì)與hrp系統(tǒng)不匹配，建議實驗前確認(rèn)顯色體系。
二、免疫熒光（immunofluorescence,if）
1、原理和特點：
? 原理：免疫熒光就是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理及特殊的熒光素標(biāo)記技術(shù)，通過激光激發(fā)使熒光素發(fā)出熒光，在熒光顯微鏡下觀察熒光的變化從而對細(xì)胞內(nèi)的抗原進行分析的技術(shù)。用免疫熒光顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）技術(shù)。
? 特點：免疫熒光具有特異性強、敏感性高、速度快等特點。
2、原理示意圖：
3、實驗流程：
4、常見問題分析：
a、背景過高
? 一抗質(zhì)量不高，建議使用特異性高、效價高的一抗。
? 一抗/二抗?jié)舛忍?，建議降低一抗/二抗?jié)舛取?br>? 封閉不*，建議增加蛋白封閉時間。
? 洗滌不充分，建議增加沖洗次數(shù)與時間。
? 可通過調(diào)節(jié)熒光顯微鏡的參數(shù)來減低背景。
b、信號弱或無信號
? 無目的蛋白或表達量極少，建議選用表達量高的細(xì)胞或組織。
? 細(xì)胞通透性差，建議增加通透劑的作用時間或濃度。
? 一抗/二抗?jié)舛忍?，建議增大其濃度。
? 二抗選擇錯誤（種屬不匹配），建議選用與一抗種屬相匹配的二抗。
c、熒光猝滅快
? 熒光素本身特性決定，光穩(wěn)定性差，建議選用光穩(wěn)定性好的熒光素二抗。
? 用普通的封片劑封片，建議選用防熒光猝滅劑封片。
d、細(xì)胞有自發(fā)熒光
? 使用了戊二醛固定，建議在固定后熒光染色前進行熒光淬滅，如使用naio4，nabh4，*等，染色前檢查自發(fā)熒光。
? 材料本身（如石蠟）有自發(fā)熒光，建議設(shè)立陰性對照，通過降低熒光顯微鏡的參數(shù)來消除背景染色。
? 細(xì)胞成分中能夠產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子（例如核黃素、細(xì)胞色素等）的含量高；培養(yǎng)細(xì)胞中死細(xì)胞／活細(xì)胞比例高；
三、流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry, fc）
1、定義、原理
? 流式細(xì)胞儀（flow cytometor）：
進行流式細(xì)胞分析的儀器，是集光電子物理，光電測量，計算機，細(xì)胞熒光化學(xué)，抗體技術(shù)為一體的高科技細(xì)胞分析儀。
? 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry）：
利用流式細(xì)胞儀對處于快速流動的細(xì)胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速（每秒可達1000-10000個）的定量分析和分選（純度可達99%以上）的技術(shù)。
2、反應(yīng)原理示意圖：熒光物質(zhì)（fitc、pe等）
3、實驗流程：
4、常見問題分析：
a、熒光強度/背景過高
? 一抗/二抗?jié)舛忍?，建議降低一抗/二抗?jié)舛取?br>? 封閉不*，建議增加蛋白封閉時間。
? 洗滌不充分，建議增加沖洗次數(shù)與時間。
b、信號弱或無信號
? 無目的蛋白或表達量極少，建議選用表達量高的細(xì)胞。
? 細(xì)胞通透性差，建議增加通透劑的作用時間或濃度。
? 一抗/二抗?jié)舛忍停ㄗh增大其濃度。
? 二抗選擇錯誤（種屬不匹配），建議選用與一抗種屬相匹配的二抗。
c、柱形圖分析時出現(xiàn)熒光雙峰
? 抗原本身特性所決定（比如不同時期的細(xì)胞蛋白表達量不同）
? 進樣針堵塞，建議清洗管路。
? 進樣速度太快，建議調(diào)低進樣速度。
d、管路系統(tǒng)偏移導(dǎo)致焦距偏離，建議請專業(yè)維修人員校準(zhǔn)。
四、免疫組化（ihc）、免疫熒光(if)、流式細(xì)胞術(shù)區(qū)別(fc)：
流式細(xì)胞術(shù)（fc）
免疫組化（ihc）、免疫熒光（if）
控制
電腦（客觀）
人（主觀）
結(jié)果顯示方式
熒光激發(fā)后被探測子捕獲信號
化學(xué)顯色/熒光通過顯微鏡觀察拍片
樣本
單細(xì)胞（或顆粒）懸液（流動）
組織切片/細(xì)胞爬片（靜止）
細(xì)胞數(shù)量
大（上萬個）
小
樣本利用
分選后可回收利用
不可回收利用
結(jié)果揭示信息
細(xì)胞群體特征分布
揭示細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息
功能
可同時檢測多個參數(shù)
一個或幾個參數(shù)